الخلايا الجذعية الجنينية

لم ينشأ اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية مصادفةً، بل ظهر في بيئة بحثية مُمهدة في مجال علم الأحياء النمائي. أُدخل مصطلح "الخلايا الجذعية" في الطب عام ١٩٠٨ في مؤتمر جمعية أمراض الدم في برلين على يد ألكسندر ماكسيموف، وذلك فيما يتعلق بالخلايا المكونة للدم. قبل عزل وإنتاج سلالات مستقرة من الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات بوقت طويل، استُخدمت الخلايا الجذعية المسخية (سرطانة الجنين) في دراسات عمليات النمو المبكرة، والتي دُرست من خلالها آليات غير معروفة لتكوين الأجنة، بما في ذلك تسلسل التعبير الجيني المبكر ومنتجات البروتين الناتجة عن نشاطها.

لكن هل فُقدت القدرة الكلية للجينوم البشري بشكل لا رجعة فيه في عملية التطور؟ لا، وتكوين الأجنة دليل على ذلك. إذا كان الأمر كذلك، فمتى، من حيث المبدأ، سيتحقق المسار الثاني للتطور؟ ربما، عندما يدخل الإنسان الفضاء، حيث ستكون الظروف البيئية ثابتة نسبيًا لفترة طويلة بما فيه الكفاية. يمكن اعتبار فقدان أنسجة العظام (إزالة المعادن من العظام في حالة انعدام الوزن)، والتي تخضع ببطء شديد لإعادة التشكيل والتجدد، الخطوة الأولى في عملية تكيف الإنسان، كنوع، مع الوجود في ظروف الفضاء. ومع ذلك، فإن ثمن المسار الثاني للتطور التطوري سيكون مختلفًا - ثمن عودة القدرة الكلية والمرونة المطلقة لجميع الخلايا سيكون العقم. لذا، في عالم "الحرباء التطورية" هذا، سيتعين علينا التكاثر دون انقسام منصف، عن طريق التبرعم. لكننا سنعيش طويلًا. خلود التيلوميراز هو خلود الأميبا. في الكائن الحي متعدد الخلايا، تعتبر الخلايا الجذعية هي الركيزة لطول العمر الكمي والنوعي.

[ 1 ]، [ 2 ]، [ 3 ]، [ 4 ]

مصادر الخلايا الجذعية الجنينية

اليوم، تُعدّ سلالات سرطان الخلايا المسخية الفأرية (129/sv، F19، F8، Zin 40، CGR 86، Rl، CCE، JM-1، E14TG2a، CGRSb) وسرطان الخلايا المسخية البشرية (NTERA-2، TERA-2، H-9 clone)، بالإضافة إلى سلالات الخلايا الجذعية الجنينية من Trauneon، مصادر الخلايا الجذعية الجنينية للأبحاث المخبرية. إلا أن توافر جواز سفر خلوي مفصل يُشير إلى النمط المناعي، ونتائج تحليل الكروموسومات، وأنماط تعبير mRNA، والمستقبلات المكشوفة، وبروتينات الإشارة داخل الخلايا، لا يُعوّض عن العيوب الكبيرة في سلالات خلايا سرطان الخلايا الجذعية الجنينية - الفقدان السريع لكامل القدرة الخلوية، واستحالة استخدامها في التجارب السريرية، في حين أن التمايز المختلط في المزرعة يجعل من الصعب للغاية عزل سلالة متخصصة نقية من مجموعة خلوية غير متجانسة. لذلك، فإن مصدر خطوط الخلايا الجذعية الجنينية التي تم إنشاؤها للأغراض السريرية عادة ما يكون الكتلة الخلوية الداخلية للكيسة الأريمية، والخلايا البلاستومرية الفردية للأجنة في مرحلة الخلايا الثماني، وخلايا التوتة في المراحل اللاحقة، وكذلك الخلايا الجرثومية البدائية.

تجدر الإشارة إلى أن خلايا السرطان المسخية، على الرغم من امتلاكها خاصية تعدد القدرات، تتميز بقدرة تعدد قدرات أقل بكثير مقارنةً بالخلايا الجذعية الجنينية. نادرًا ما يؤدي اندماجها مع الخلايا الجنينية إلى تكوين خلايا كيميرا، والتي، علاوة على ذلك، لا تُكوّن أمشاجًا تحمل النمط الجيني لخلايا السرطان المسخية. يُعتقد أن هذا يعود إلى تكرار حدوث تشوهات كروموسومية أثناء زراعة خلايا السرطان المسخية: فقدان الكروموسوم Y، أو حالات تثلث صبغي مختلفة، أو حالات حذف أو انتقال.

بُذلت محاولات متكررة لعزل خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، ولكن لم تُحل هذه المهمة نظرًا لصعوبة الوصول إلى الكيسة الأريمية البشرية الطبيعية. إضافةً إلى ذلك، فإن معدل حدوث التشوهات الكروموسومية لدى البشر أعلى منه في تكوين الأجنة الحيوانية. تُظهر الغالبية العظمى من الأجنة البشرية المبكرة التي يتم الحصول عليها بعد التلقيح الصناعي فسيفساء كروموسومية فوضوية، وغالبًا ما تحتوي على انحرافات عددية وبنيوية. وحتى في مرحلة لاحقة، في مرحلة الكيسة الأريمية، تتكون نسبة 20-25% فقط من الأجنة البشرية من خلايا ذات نمط نووي طبيعي. كان من المستحيل تقريبًا استخدام مثل هذه الأجنة لإنشاء الخلايا الجذعية الجنينية، حيث كانت تُزرع عادةً الزيجوتات إلى مرحلة الكيسة الأريمية المكونة من بويضتين أو أربع بويضات ثم تُزرع في الرحم. لم تُطور إلا مؤخرًا نسبيًا تقنية موثوقة لزراعة البويضات البشرية المخصبة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. إن إدخال هذه التقنية في ممارسة التلقيح الصناعي لم يؤدي إلى زيادة معدل نجاح نتائج الزرع فحسب، بل جعل أيضًا من الممكن الوصول إلى الأجنة الكيسية الطبيعية بسهولة أكبر.

مصدر آخر للخلايا الجذعية متعددة القدرات هو الخلايا الجرثومية البدائية، والتي، على عكس المجموعات السلفية الأكثر تقدمًا في الظهارة الجرثومية، لا تحتوي على بيتا إنتغرين على سطحها، ولكنها تُظهر نشاطًا عاليًا للفوسفاتاز القلوي. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات الخلايا الجذعية المتكونة من الخلايا الجرثومية البدائية دُرست تجريبيًا منذ ثمانينيات القرن الماضي. في ذلك الوقت، طُوّرت تقنية لعزل الخلايا الجرثومية البدائية من بدايات غدة تناسلية جنين الفأر. أشارت النتائج الأولى غير الناجحة لزراعة الخلايا الجرثومية البدائية في المختبر إلى عدم جدوى هذه المحاولات، لأن الخلايا، على الرغم من بقائها، لم تتكاثر وماتت في غضون اليوم الأول. ثبت لاحقًا أن الخلايا الجرثومية البدائية للفأر تتكاثر في المختبر فقط في وجود عوامل نمو بولي ببتيدية محددة قابلة للذوبان ومرتبطة بالغشاء في وسط الزراعة. أظهرت نتائج دراسات عديدة أن بقاء الخلايا الجرثومية الأولية وتكاثرها يتطلبان وجود عوامل الفولاذ (LIF) المرتبطة بالغشاء والقابلة للذوبان (SIF) في وسط الزراعة. تُنتج هذه الببتيدات بواسطة خلايا جسدية لأجنة متماثلة اللواقح لطفرة الفولاذ، وأحدها ربيطة للجين الأولي cKit.

الخلايا الجرثومية الأولية للثدييات والبشر لها أصل خارج الغدد التناسلية، وهي مصدر التطور النسيلي لسلالة الخلايا الجرثومية. أصل سلالة الخلايا الجرثومية البدائية، وكذلك جميع الأنسجة الجنينية والأديم المتوسط خارج الجنيني، هو الأديم الظاهر الأولي للأجنة المبكرة، والذي يتميز بتنظيم هيكلي فسيفسائي. باستخدام طريقة الاستئصال المجهري لأجزاء مختلفة من الجنين المبكر، تم تحديد منطقة تموضع في الأديم الظاهر لنسخة السلائف الملتزمة للخلايا الجرثومية البدائية. باستخدام رودامين ديكستران، الذي استُخدم كعلامة خلوية، ثبت أن أسلاف الخلايا الجرثومية البدائية تقع في المنطقة القريبة من الأديم الظاهر، بالقرب من الأديم الظاهر خارج الجنيني. ينشأ خط الخلايا الجرثومية البدائية من نسخة مكونة من 45 خلية، يحدث توزيعها في بداية تكون المعيدة. ثم ينفصل النسيلة، وخلال عملية التكوّن المعدي، تدخل الخلايا الجرثومية الأولية الأديم المتوسط خارج الجنين، وتوجد عند قاعدة أساس السقاية، خلف الشريط الأولي. ومن هناك، تهاجر الخلايا الجرثومية الأولية نحو الجزء البطني من الأديم الباطن للأمعاء الخلفية، ثم تتحرك بنشاط على طول المساريقا، لتملأ التلال التناسلية في نهاية الهجرة. أثناء الهجرة، وكذلك في أول يومين إلى ثلاثة أيام من تمركزها في أساس الغدد التناسلية، تتكاثر الخلايا الجرثومية الأولية بنشاط وتخضع لثماني دورات تكاثر. إذا كان هناك حوالي 50 خلية جرثومية أولية في بداية الهجرة، فإن عدد الخلايا الجرثومية الأولية في التلال التناسلية لأجنة الفئران التي يبلغ عمرها اثني عشر يومًا من التطور يتجاوز 25000 خلية.

يتجلى التشابه الوظيفي بين الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجرثومية البدائية في اندماج الأخيرة الكامل في الكيسة الأريمية مع استبدال الكتلة الخلوية الداخلية، وما تلاه من نمو كامل للجنين، الذي تتكون أنسجته فقط من نسل الخلايا الجرثومية البدائية. وفي خصائص أخرى، تبيّن أن الخلايا الجرثومية البدائية للفأر مطابقة للخلايا الجذعية الجنينية، مما يُظهر قدرتها على التمايز في اتجاهات متعددة، وتكوين أجسام جنينية في المختبر، وتكوين أورام مسخية في الجسم الحي عند حقنها تحت الجلد لفئران تعاني من نقص المناعة، وهي تُشبه أورام المسخ الخصوية العفوية لدى فئران 129/ter.

وُجد أنه عند إضافة LIF وSIF المرتبط بالغشاء والقابل للذوبان إلى الوسط، تبقى الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة لأجنة فئران عمرها 8 أيام على قيد الحياة وتتكاثر في المزرعة لمدة 4 أيام، ثم تموت. علاوة على ذلك، تتزامن فترة ملاحظة موت الخلايا الجرثومية الأولية في المزرعة مع مرحلة نمو أجنة الفئران (12.5-13.5 يومًا) عندما تدخل الخلايا الجرثومية الأولية الأنثوية في الانقسام المنصف في بدايات الغدد التناسلية، وتُمنع الانقسامات الانقسامية في الخلايا الجرثومية الأولية الذكرية. ومع ذلك، إذا لم تتم إضافة عوامل النمو LIF وSIF فحسب، بل FGF2 أيضًا إلى الوسط، تستمر الخلايا الجرثومية الأولية في التكاثر، وتتشكل مستعمرات من الخلايا القادرة على التكاثر حتى بعد إزالة عوامل النمو (SIF وFGF) من الوسط في المزارع الفرعية. يمكن زراعة هذه الخلايا لفترة طويلة على ركيزة من الخلايا الليفية الجنينية دون إضافة عامل النمو القابل للذوبان LIF. اقتُرح تسمية هذه السلالات الخلوية المستقرة، المُستخلصة من الخلايا الجرثومية البدائية، بالخلايا الجرثومية الجنينية. إلا أن هذا المصطلح غير مُوفق إطلاقًا، إذ يستحيل الحصول على خلايا جرثومية جنينية قادرة على إتمام مراحل لاحقة من تكوين البويضات أو الحيوانات المنوية عند زراعة الخلايا الجرثومية. ويرجع ذلك إلى أن سلالات الخلايا الجرثومية، على الرغم من أنها تنشأ من الخلايا الجرثومية البدائية، إلا أنها تفقد قدرتها على الارتباط بالسلالات الجرثومية عند اكتساب خصائص الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات في المزرعة. بمعنى آخر، تفقد الخلايا الجرثومية البدائية، عند زراعتها، خصائص أسلاف الأمشاج وتتحول إلى خلايا متعددة القدرات شبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية.

لُوحظ أن الأورام المسخية لا تنشأ عند إدخال خلايا EG إلى فئران تعاني من نقص المناعة. ويُفترض أن فقدان قدرة خلايا EG البشرية على إنتاج الأورام المسخية يعود إلى أن هذه السلالات لم تُخلق مباشرةً من خلايا جرثومية أولية مزروعة، بل حُصل عليها من خلايا معزولة من أجسام جنينية. لذلك، من الممكن أن تكون هذه السلالات من نسل خلايا متعددة القدرات، ولكنها مُلتزمة بالفعل.

تجدر الإشارة إلى وجود اختلافات جوهرية بين الخلايا الجرثومية البدائية والخلايا الجرثومية البدائية. فالخلايا الجرثومية البدائية لا تسمح بالحصول على أجنة فئران هجينة، مما يدل على عدم قدرة الخلايا الجرثومية البدائية على الاندماج في الكتلة الخلوية الداخلية أو الأديم الظاهر المغذي. وتشبه خصائص مجموعة الخلايا الجرثومية البدائية خطوط الخلايا الجسدية الملتصقة بالأجنة اللاحقة، والتي لا يؤدي إدخالها في الكيسة الأريمية إلى تكوين أجنة هجينة.

أتاح تعديل تقنية زراعة الأجسام الجنينية المُنتَجة عن طريق تجميع خلايا EG الحصول على مجموعة أخرى من الخلايا متعددة القدرات، تُسمى "خلايا الجسم الجنيني المشتقة" (خلايا EBD)، وذلك باستخدام الانتقاء الطبيعي على بيئات انتقائية. وقد أتاحت قدرة خلايا EBD على التكاثر في المزرعة لفترة طويلة إنشاء سلالات خلوية مستقرة من الخلايا الملتزمة. وتم الحصول على نسخ من الخلايا تُعبّر عن مجموعة واسعة من علامات mRNA والبروتينات للخلايا المتخصصة. وقد أثبت هذا النهج في النهاية أن الخلايا الجرثومية الأولية البشرية متعددة القدرات، وتتمايزها في المختبر إلى أنواع مختلفة من الخلايا: الخلايا العصبية، والخلايا الدبقية، والبطانة الوعائية، والخلايا المكونة للدم، والخلايا العضلية، وخلايا الأديم الباطن.

مصادر بديلة للخلايا الجذعية الجنينية

قد تكون الخلايا الهجينة مصدرًا بديلًا لسلالات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. يُتيح زرعُ تركيب غير متجانس في رحم أبقار شبه حامل، مُنتَج عن طريق دمج الخلايا الجسدية للجنين البشري مع بويضة بقرة أُزيلت منها النواة الأولية سابقًا، الحصول على كتلة خلوية داخلية من جنين اصطناعي في مراحل نمو ما قبل الزرع. ولهذا الغرض، تُستخرج في المرحلة الأولى الكيسة الأريمية من بويضة بقرة مزروعة بنواة خلية بشرية.

في المرحلة الثانية، تُعزل الأرومة الجنينية من الكيسة الأريمية، ومنها تُعزل الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة طومسون. يُذكر أن أفضل النتائج في عزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام هذه الطريقة قد تم الحصول عليها باستخدام أنوية الخلايا الجريبية أو الخلايا الجرثومية الأولية التي تبقى في جسم الإنسان في حالة سبات. ويرجع ذلك إلى أن أنوية الخلايا البشرية المزروعة في بويضة بقرة يجب أن تحتوي على تيلوميرات غير قصيرة ونشاط تيلوميز مرتفع، مما يساعد على تجنب الشيخوخة المبكرة لنسائل الخلايا الجذعية الجنينية المأخوذة من بويضة هجينة (ريبين، 2001). من المعروف أن أهم بروتينات الواسمة داخل الخلايا للخلايا الجذعية الجنينية هي Oct3 وOct4 وTcf وGroucho، والتي تنتمي إلى ما يسمى ببروتينات كاتم الكروماتين. توفر هذه البروتينات حزمة كثيفة من الهيتروكروماتين، مما يمنع تكوين حلقات الكروماتين الحقيقي. يرتبط تغليف الكروماتين الذي تتوسطه هذه البروتينات بتكامل جينوم الخلايا الجذعية الجنينية. وقد ثبت حتى الآن أن البويضات الناضجة من الأبقار والبشر هي النوع الوحيد من الخلايا المتخصصة التي تحتوي على تركيزات عالية من بروتينات الكاتم في السيتوبلازم. وبناءً على ذلك، طُوّرت طريقة للحصول على خلايا جذعية جنينية هجينة عن طريق نقل نوى الخلايا الجسدية إلى بويضات بقرية منزوعة النواة. وقد أظهرت الدراسات الأولية المختبرية أن سيتوبلازم بويضات الأبقار يُعيد تكامل جينوم نوى الخلايا الجسدية البشرية بعد 12-24 ساعة من الزراعة.

تُعدّ البيانات المتعلقة بخصائص نمو الأجنة البشرية قبل الزرع ذات أهمية خاصة، إذ تشير إلى استبدال الخلايا متعددة القدرات بالخلايا متعددة القدرات لاحقًا مقارنةً بالفئران. وقد أظهرت دراسة للتحولات الخلوية أن خلايا الأرومة الغاذية تنشأ أيضًا من خلايا الكتلة الخلوية الداخلية للكيسات الأريمية البشرية، بالإضافة إلى الخلايا الجذعية الجنينية، مما يشير إلى كفاءتها الكلية.

من المعروف أنه في مرحلة الكيسة الأريمية، تنشأ مجموعتان خلويتان مختلفتان في الالتزام. تُشكل إحداهما الطبقة الخارجية من الكيسة الأريمية - الأديم الظاهر المغذي، ومشتقاته هي خلايا الأرومة الغاذية والمكونات الجنينية الأخرى للمشيمة. تتجمع المجموعة الثانية من الخلايا في كتلة كثيفة تلامس السطح الداخلي للأديم الظاهر المغذي. مشتقات مجموعة خلايا الكتلة الخلوية الداخلية هي جميع أنسجة وأساسات أعضاء الجنين. في مرحلة الكيسة الأريمية المتأخرة، يتكون الأديم الباطن خارج الجنيني من الكتلة الخلوية الداخلية ويتكون الأديم الظاهر (الأديم الظاهر الأولي). في هذه الحالة، تحتفظ خلايا الأديم الظاهر بتعدد القدرات، بينما تكون القدرة على تمييز خلايا الأديم الباطن خارج الجنيني محدودة.

[ 5 ]، [ 6 ]، [ 7 ]، [ 8 ]، [ 9 ]، [ 10 ]، [ 11 ]

الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

حتى وقت قريب، كان يُعتقد استحالة الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية من الأرومة الغاذية. ومع ذلك، تتكاثر سلالة من الخلايا الجذعية ثنائية الصيغة الصبغية للأديم الظاهر المغذي، المعزولة من الكيسة الأريمية، وتتحول إلى خلايا جذعية في وسط يحتوي على عامل نمو الخلايا FGF2 والهيبارين بدلاً من عامل تنشيط الليباز. عند إزالة عامل تنشيط الليباز FGF2 من الوسط، تتوقف خلايا الأديم الظاهر المغذي عن التكاثر، ويبدأ تضاعف الكروموسومات فيها، وتتحول عناصر خلايا الأديم الظاهر المغذي تدريجيًا إلى خلايا أرومة غاذية عملاقة. على الأرجح، لا يحفز عامل تنشيط الليباز تكاثر خلايا الأديم الظاهر المغذي نظرًا لأن عامل نمو الخلايا FGF2 يُحفز آلية إرسال إشارات مختلفة، حيث إن ارتباطه بمستقبل البلازما (FGFR2) يُنشط كينازات MAP في السيتوبلازم - ERK1 وERK2. وبالتالي، عند تفعيل أحد مسارات الإشارة (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) في خلايا الكيسة الأريمية، تتحول خلايا الكتلة الخلوية الداخلية إلى خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات، وعند تفعيل الآلية الثانية لنقل الإشارة عبر الغشاء (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2)، تتشكل الخلايا الجذعية الغاذية الظاهرية في الكيسة الأريمية. ويعتمد اختيار مسار الإشارة بدوره على نشاط جين oct4. يقع هذا الجين، الذي ينتمي إلى نطاق POU، في موضع t للصبغي الجسدي 17، ويُعبَّر عنه أثناء التبويض، وخلال فترة الانقسام، وكذلك في خلايا الكتلة الخلوية الداخلية للكيسة الأريمية وفي الخلايا الجرثومية الأولية. ويتمثل الدور الوظيفي لجين oct4 في ترميز عامل النسخ الضروري لظهور الخلايا متعددة القدرات، وتمايزها وإلغاء تمايزها.

يختلف التعبير عن جين oct4 في الخلايا الجذعية الجنينية تبعًا لتفاعل عامل النسخ هذا مع العوامل المساعدة. أظهر التنظيم الموجه للتعبير عن oct4 في الكيسات الأريمية أنه عند انخفاض نشاطه، يُشكل نصف الخلايا طبقةً غشائيةً، بينما عند زيادة التعبير المُستحث عن oct4، تنشأ الخلايا الجذعية الجنينية بشكل رئيسي.

في التجربة، لا يمكن نقل الخلايا الجذعية الجنينية إلى سلالة أثناء زراعة الخلايا البلعمية متعددة القدرات في مرحلة الانقسام، وكذلك في مرحلة التكوّن المعدي والمراحل اللاحقة من التطور الجنيني. عادةً ما تُعزل الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في اليوم 3.5-4.5 من الحمل، وهو ما يتوافق مع المرحلتين السادسة (الكيسة الأريمية أحادية الطبقة) والسابعة (الكيسة الأريمية ثنائية الطبقة - أسطوانة البيض المبكرة) من التكوين الجنيني الطبيعي. من الواضح أن أجنة الفئران لا تحتوي على مجموعات خلوية قادرة على التحول إلى خلايا جذعية جنينية إلا في فترة ما قبل الزرع. وبالتالي، لا يمكن عزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية إلا في مراحل معينة من التكوين الجنيني. تكون الزيجوتات والخلايا البلعمية التي تنشأ أثناء الانقسام متعددة القدرات، من وجهة نظر إمكانية تطوير جنين قابل للحياة بأغشية جنينية ومشيمة. يبدأ فقدان القدرة الكلية للخلايا الجرثومية في مرحلة التوتة المتأخرة، عندما يعتمد المزيد من التزام الخلايا البلعمية على موقعها. تحتفظ الخلايا المتفجرة المبكرة من التوتة بقدرتها الكاملة على التكاثر، حيث إن التلاعبات التجريبية بتغييرات في موقعها، مثل عكس موقعها، لا تمنع تطور الجنين الكامل.

ثبت أن كفاءة عزل الخلايا الجذعية الجنينية في سلالة واحدة تتأثر بحالة الكيسة الأريمية وقت زراعتها. إن استخدام الكيسة الأريمية بعد نمذجة فترة سبات مدتها سبعة أيام في الجهاز التناسلي للفئران المستأصلة مبيضها في اليوم الثالث والنصف من الحمل والمُعطاة هرمون البروجسترون يُسهّل عزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية بنجاح أكبر. ويُفترض أنه في ظل هذه الظروف، يزداد عدد الخلايا الأريمية التي تُشكل الكتلة الخلوية الداخلية. ومن الممكن أيضًا أن تطول دورة الخلية وتدخل معظم الخلايا الأريمية في طور G0.

بالإضافة إلى ذلك، يعتمد تكوين سلالات خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات ومستقرة على النمط الجيني للأجنة: إذ يسهل عزل الخلايا الجذعية الجنينية من الكيسات الأريمية لسلالة الفأر 129، بينما يصعب الحصول عليها باستخدام فئران CS7BL/6، ويكاد يكون من المستحيل عزل سلالة خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية لفئران CBA/Ca. من الواضح أن الأجنة المبكرة تحمل بعض السمات الجينية التي تؤثر على نمو سلالة خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات. ومع ذلك، عند زراعة الأديم الظاهر المعزول، وكذلك عن طريق الانتقاء الانتقائي للخلايا المتمايزة، تم عزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية من الأجنة المبكرة لفئران CBA/Ca.

تتضمن الأدلة المخبرية المتعلقة بتقنيات التجارب على الأجنة المبكرة تقنية قياسية مثبتة للحصول على سلالات الخلايا الجذعية الجنينية من الكيسات الأريمية. ويمكن أيضًا الحصول على سلالات الخلايا الجذعية الجنينية التجريبية عن طريق زراعة الأديم الظاهر المعزول (الأديم الظاهر الأولي) لأجنة فئران عمرها 4.5 يوم باستخدام تقنية جراحية مجهرية معقدة وظروف زراعة مُعدّلة. وتُبرر هذه العملية شدّتها، حيث تبيّن أن معدل تكوين سلال الخلايا الجذعية الجنينية في هذه الحالة أعلى بكثير منه في الأعمال التي تُجرى على الكتلة الخلوية الداخلية للكيسة الأريمية.

لعزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية، تُنقل كل خلية إلى بئر مجهري، وتُزرع مجموعة من 40-60 خلية، ثم تُشتت مرة أخرى. تتيح لنا التكرارات المتعددة لهذه العملية الحصول على سلالة خلايا جذعية جنينية خالدة بأقصى معدل تكاثر للخلايا ذات النمط الطبيعي المرتبطة بالبلاستيك، والتي تحتفظ بقدرة تكاثرية كاملة ونشاط تيلوميراز مرتفع بعد 50-100 عملية. في عملية الحفاظ على سلالات الخلايا الجذعية الجنينية، يتمثل الخطر الأكبر في تلوث الوسط أو المصل بالسموم الداخلية البكتيرية - فحتى التركيزات الضئيلة من السموم الداخلية في وسط الزراعة تسبب موتًا جماعيًا للخلايا الجرثومية غير الناضجة. مع المراقبة الدقيقة للنمو الخطي والتشتت في الوقت المناسب، تكون الخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة قادرة على الانقسام المتماثل، حيث تظل كلتا الخليتين الابنتين متعددتي القدرات وقادرتين على أداء عدد غير محدود من الدورات الخلوية، مع الحفاظ على النمط النووي ثنائي الصبغيات وفعالية كاملة.

يمكن اختيار مجموعة نقية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بعد نقل جينومها باستخدام جزيئات الحمض النووي المُعاد تركيبها (DNA) التي تحتوي على الجين المُشفر لتخليق البروتين الفلوري الأخضر (GFP). يزداد التعبير الجيني للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) عند زراعة الخلايا الجذعية الجنينية في ظروف تدعم تكاثرها، بينما ينخفض مستوى التعبير الجيني لهذا الجين مع بداية التمايز، مما يسمح باختيار سلالات خلوية متعددة القدرات نقية ومستقرة على وسط انتقائي. عند زراعة الخلايا الجذعية الجنينية المعزولة باستخدام انتقاء البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، يزداد معدل تكوين المستعمرات أضعافًا مضاعفة، نظرًا لزوال التأثير المضاد للتكاثر القوي للخلايا المتمايزة في ظروف مزارع الانتقاء.

تُجرى عملية تحويل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى خط باستخدام طريقة عزلها من أجنة ما قبل الزرع (في مرحلة 80-120 خلية)، والتي تبقى بعد إجراء التلقيح الصناعي. ولهذا الغرض، تُوزّع الأجنة "الفائضة" المُحصّلة صناعيًا ميكانيكيًا في وسط Delbecco-Eagle. بعد وسم الخلايا بأجسام مضادة وحيدة النسيلة انتقائية ذات علامة فلورية، تُعزل خلايا الأرومة الجنينية. تُوزّع الأرومة الجنينية في خلايا فردية باستخدام خليط من إنزيم ديسباس-كولاجيناز. تُزرع الخلايا المنفصلة في وسط خاص (80% من وسط Delbecco + 20% من مصل جنين العجل، مع 500 ميكروغرام/مل من IL-6 وLIF وSCF) فوق طبقة أحادية مُغذّية من الخلايا الليفية الجنينية من الممرات الثلاث الأولى. في هذه الحالة، يُحافظ على بقاء وانتشار الخلايا الجذعية والسلفية بفضل تأثير IL-6 وLIF وSCF. في مثل هذا الوسط، تنمو الخلايا الجذعية الجنينية كخلايا مُعلقة مُكوّنة من خلايا مُتكوّرة غير مُرتبطة، والتي يجب فصلها عن طريق التقطير المتكرر والناعم. تظهر الخلايا الجديدة في المزرعة المُعلقة في اليوم الخامس والسابع. يتحقق أقصى معدل نمو للخلايا الجذعية الجنينية عن طريق الفصل المتكرر للخلايا في مرحلة 10-15 خلية. بعد ذلك، تُنقل كل خلية إلى بئر مجهري وتُنمّى إلى مجموع 40-50 خلية. تُكرّر هذه العملية عدة مرات في الممرات، مما يزيد من حجم المزرعة إلى كثافة 5-10 ملايين خلية لكل طبق قطره 6 سم. باستخدام هذا التمرير، عزل تومسون 10 مستنسخات خالدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والتي احتفظت بعد 100 عملية تكاثر بنشاط عالٍ من التيلوميراز، والقدرة على التكاثر بقوة، وخصائص ظاهرية ضئيلة، وفعالية كاملة مع القدرة على التمايز إلى أي من 350 سلالة خلوية متخصصة مشتقة من الأديم الظاهر والوسطى والباطني. بدأ تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (عند تغيير الوسط، وإضافة المصل، وإزالة عامل نمو الخلايا الجذعية) مع التصاق الخلية بالركيزة، مما يشير إلى تطور الهيكل الخلوي والتعبير عن مستقبلات الالتصاق. والأهم من ذلك، مع التكاثر غير المحدود، احتفظت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بنمط نووي طبيعي.

تعتمد الطريقة الثانية لعزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على استخدام الخلايا الجرثومية الأولية. وقد أظهرت الدراسات التجريبية إمكانية الحصول على سلالات الخلايا الجرثومية الأولية من الطيات التناسلية لأجنة فئران عمرها 12.5 يومًا. ومع ذلك، في هذه الحالات، كان معدل تكوين سلالات الخلايا السلفية أقل بكثير مما هو عليه في التجارب على الأجنة السابقة. في الوقت نفسه، لا تستطيع الخلايا الجرثومية الأولية من الغدد التناسلية لأجنة فئران عمرها الحملي 13.5 يومًا التحول إلى سلالات على الإطلاق.

تم الحصول على أول سلالات مستقرة من خلايا EG البشرية متعددة القدرات من الخلايا الصبغية الأولية المعزولة من الغدد التناسلية لأجنة تتراوح أعمارها بين 5 و9 أسابيع. زُرعت الخلايا المعزولة على ركيزة من الخلايا الليفية الجنينية المعطلة للفأر في وسط DMEM مع مصل جنيني مضاف إليه ميركابتويثانول وفورسكولين وعوامل النمو البشري المؤتلف (FGF وLIF). بعد 7-12 يومًا، ظهرت مستعمرات متعددة الخلايا في المزرعة، تتوافق مع خلايا EG البشرية من حيث السمات المورفولوجية والعلامات الجزيئية. بعد التكتل، شكلت هذه الخلايا أجسامًا جنينية، ومع مزيد من التطور، ظهرت خلايا متخصصة مميزة لمشتقات الطبقات الجرثومية الثلاث. على مدار 10-20 دورة، احتفظت سلالات خلايا EG بنمطها النووي الطبيعي ولم تفقد تعدد القدرات.

وقد ثبت أيضًا أن التأثير المشترك لعامل التكاثر LIF، وعوامل الفولاذ القابلة للذوبان والمرتبطة بالغشاء، وعامل النمو المحول TGF-b يُغيّر البرنامج التنموي للخلايا الجرثومية البدائية. فبدلًا من توقف الانقسامات الانقسامية والبدء بالتمايز نحو تكوين البويضات أو الحيوانات المنوية، تستمر الخلايا الجرثومية البدائية في التكاثر. وبعد عدة دورات انقسامية إضافية، تُصبح مشابهة لخلايا الأديم الظاهر، وتفقد خصائص أسلاف الخلايا الجرثومية، وتتحول إلى خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات.

وهكذا، في عام ١٩٩٨، عُزلت لأول مرة سلالات مُخلَّدة من الخلايا الجرثومية البدائية من البدائية التناسلية لأنسجة تشريح جنين بشري. في مرحلة التخلق الجنيني البشري، تظهر الخلايا الجرثومية البدائية في الكيس المحي في الأسبوع الثالث من النمو، وفي الأسبوعين الرابع والخامس، تهاجر هذه الخلايا إلى منطقة الدرنة التناسلية، حيث تُشكِّل مجموعات خاملة من الخلايا الصبغية الأولية. في حالة الخمول، تُحفَظ الخلايا الجرثومية البدائية في الجنين حتى الولادة. تُعزل سلالات من الخلايا الجرثومية البدائية من الدرنة التناسلية للجنين لأجنة تتراوح أعمارها بين ٥ و٩ أسابيع، ويُعالَج النسيج المُستخلص منه مؤقتًا بمزيج من الكولاجينازات من النوع الرابع إلى الخامس، والهيالورونيداز، وDNase لزيادة إنتاج الخلايا كميًا ونوعيًا. تُحاط الخلايا الجرثومية البدائية في نسيج الدرنة التناسلية الجنينية بخلايا سيرتولي السدوية (الميزانشيمية). والغرض الوظيفي لخلايا سيرتولي هو إنتاج عوامل مضادة لموت الخلايا المبرمج (ربيطة فاس)، ومولدات للانقسام، ومثبطات للمناعة تحمي الخلايا الجرثومية من الهجوم المناعي للجسم. إضافةً إلى ذلك، تلعب البيئة الدقيقة السدوية للدرنة التناسلية دورًا هامًا في نضج الأمشاج. تُزرع الخلايا الجرثومية البدائية المعزولة في مزرعة فوق طبقة سدوية مُغذية تتكون من الخلايا الليفية الجنينية للممرات الثلاثة الأولى. وأكثر تركيبات مولدات الانقسام فعالية هو مركب يتكون من LIF وFGF والفورسكولين (محفز لتكوين cAMP). يتطلب تكاثر الخلايا الجرثومية البدائية في المختبر إضافة مصل جنيني، حيث يصاحب تكاثر الخلايا الصبغية البدائية في المزرعة تكوين نسائل من خلايا كروية غير متصلة بالركيزة.

في المعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة الأمريكية، واستنادًا إلى ملخص للبيانات المتوفرة حول طرق عزل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من الكيسات الأريمية، خلصت دراسة أولية إلى أن عزل الخلايا الجذعية الجنينية بنجاح يكون على الأرجح عند زراعة الكيسات الأريمية ذات كتلة خلوية داخلية مكتملة التكوين (الخلايا الجذعية: التقدم العلمي وتوجهات البحث المستقبلية. المعهد الوطني للصحة بالولايات المتحدة الأمريكية). ومن هذا المنطلق، يُعدّ الكيسات الأريمية البشرية في اليوم الخامس من النمو المصدر الأمثل للخلايا الجذعية الجنينية لإنشاء السلالات، حيث يجب إزالة الأديم الظاهر المغذي منها بعناية عند عزل الكتلة الخلوية الداخلية. يجب زراعة الكتلة الخلوية الداخلية المعزولة، والتي تتكون من 30-35 خلية في هذه المرحلة، على ركيزة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر، وهو شرط أساسي لتكوين مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة.

تحليل السمات الظاهرية للخلايا الجذعية الجنينية

من الأمور ذات الأهمية الخاصة التحليل المقارن بين الأنواع للخصائص الظاهرية للخلايا الجذعية الجنينية. وقد وُجد أن مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عبارة عن مجموعات كثيفة من الخلايا المسطحة الشبيهة بالظهارة، بينما تتكون أجسام الفئران الجنينية من تكتلات فضفاضة من الخلايا المستديرة. في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، يكون مؤشر نسبة النواة إلى البلازما أقل منه في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. تُشكل الخلايا الجذعية الجنينية للقرود مستعمرات أكثر تسطحًا من الخلايا ذات حواف غير مستوية. يمكن رؤية الخلايا الفردية بسهولة في النسخ المبكرة من الخلايا الجذعية الجنينية الرئيسية. لا تعبر الخلايا الجذعية الجنينية المتكاثرة لجميع الأنواع الحيوانية المدروسة عن جزيئات MHC من الفئتين الأولى والثانية. في الوقت نفسه، تُعطي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تفاعلًا إيجابيًا مع أجسام مضادة لـ TERA 1-60 وGCTM-2، مما يدل على وجود بروتيوغليكانات كبريتات الكيراتين/شوندروتن على سطحها، وهي سمة مميزة للخلايا الجذعية السرطانية الجنينية (السرطانية). يشير التعبير عن جين oct4 في الخلايا الجذعية الجنينية لجميع أنواع الحيوانات إلى أنه على الرغم من الاختلافات الظاهرية، فإن نفس مجموعة الجينات المسؤولة عن الحفاظ على تعدد القدرات تُنشَّط على ما يبدو في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفئران (بيرو، 2001). بالإضافة إلى ذلك، تتميز سلالات الخلايا الجذعية الجنينية المعزولة من أجنة الفئران والخنازير والأرانب والرئيسيات والماشية بخصائص مورفولوجية متشابهة، ومجموعة متشابهة من علامات التعريف الجزيئية، وآلية جزيئية متطابقة تقريبًا لتنفيذ برامج التخلق الجنيني، مما يسمح لنا بإلقاء نظرة جديدة على مشكلة زراعة الأعضاء بين الكائنات الحية.

بخلاف التكوّن الجنيني الطبيعي في الجسم الحي، لا يصاحب تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية في المختبر تكوين طبقات جرثومية، ويحدث على خلفية تثبيط جينات هوكس المتجانسة، أي دون تكوين أعضاء. ونظرًا لتعطل جينات التجزئة، يستحيل إعادة إنتاج فترات من التكوّن الجنيني مثل وضع الجسيدات، وتجزئة الجنين، وتكوين الكيس المحي، والسقاء، وغيرها من الأعضاء والأنسجة المؤقتة في مزرعة الخلايا الجذعية الجنينية. ويبدو أن الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة قد تجمدت في بداية عملية تكوين 350 خطًا تقييديًا من الخلايا المتخصصة. وبالتالي، فإن استنساخ الخلايا السلفية البنتية والخلايا الجذعية الجنينية الموضعية مركزيًا لا يمثلان سوى نموذج للجنين، حيث تتشكل خلال نموه خطوط مختلفة من الخلايا المتخصصة في وقت واحد في مناطق نسيجية مختلفة، والتي تنشأ، مع ذلك، من أسلاف مشتركة. على الرغم من ضآلة عدد المستقبلات على سطح الخلايا الجذعية الجنينية، إلا أنها تحتفظ بقدرتها على إجراء عمليات تكوين مورفولوجية بدائية، محاكيةً بذلك البنى الحجمية للجنين في مراحله المبكرة: يتجمع تعليق الخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة، ويشكل بنى تشبه الكيسة الأريمية أو حتى الأجنة اللاحقة (أسطوانات البيض). تُسمى هذه التجمعات المعلقة أجسامًا جنينية بسيطة ومعقدة على التوالي.

في التمايز المختلط، تُعبَّر الجينات المبكرة للأديم الظاهر (oct3، fgf-5، العقدي)، والأديم الباطن (gata-4)، والأديم المتوسط (brachyury)، والأديم المتوسط القلبي (pkh-2.5)، والأنبوب العصبي (msx3)، وتكوين الدم (elkf) في خلايا مختلفة من جسم جنيني واحد. باستخدام توليفات متنوعة من عوامل النمو والسيتوكينات للتأثير المُوجَّه على تكوين خلايا الطبقة الجرثومية في المختبر، أمكن في عدد من الحالات الحصول على أجسام جنينية تُعبَّر فيها جينات الأديم الظاهر أو الأديم المتوسط بشكل تفضيلي، مما يفتح الطريق أمام نمذجة تكوُّن المعيدة والمراحل الأولية لتكوين الأعضاء.

النمو الاستنساخي للخلايا الجذعية الجنينية دليل على انقسام الخلايا غير المتماثل، حيث تحتفظ خلية جذعية جنينية واحدة فقط في مركز المستنسخة بإمكانية تكاثر غير محدودة، بينما تُنتج الخلية البنت الثانية جيلاً من الخلايا السلفية التي تخضع بالفعل للتمايز. لذلك، يكون معدل تكاثر المستنسخة على محيط الجسم الجنيني أعلى منه في المركز. تخضع الخلايا الهامشية للمستنسخة النامية لتمايز عفوي مضطرب، أو تهاجر، أو تموت بآليات موت الخلايا المبرمج. تحدد هذه الأحداث مصير المستنسخة: إذا تجاوز معدل التكاثر معدل الهجرة وموت الخلايا المبرمج، يستمر المستنسخة في الزيادة في الحجم، ويحدث الاستقرار عندما يكون معدل موت الخلايا المبرمج ومعدل تكوين الخلايا الجديدة متساويين، ويحدث الانحدار عندما تكون نسبة هاتين العمليتين معكوسة. تنقسم الخلايا السلفية بشكل متماثل، أي أن كلتا الخليتين البنتين تتمايزان لاحقًا إلى سلالات خلوية متخصصة ناضجة. تختلف نسبة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا السلفية، ولكن عددها لا يمثل دائمًا سوى جزء صغير من نسبة تعداد الخلايا السلفية. لذلك، لا يمكن زيادة عدد الخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة إلا من خلال السحب الدقيق وتفكيك الخلايا في الوقت المناسب. وقد تبين أن تفكيك الخلايا في مرحلة 10-12 خلية هو الأكثر فعالية للحصول على أقصى إنتاج من الخلايا الجذعية الجنينية. يعتمد اتجاه ودرجة تمايز الخلايا في الجسم الجنيني على موقعها. لا تعبر الخلايا الخارجية للجسم الجنيني عن جين oct4 وتخضع للتمايز إلى خلايا الأديم الباطن الأولي، والتي تتشكل منها لاحقًا خلايا شبيهة بالظهارة من الأديم الباطن خارج الجنيني الجداري والحشوي. تعبر الخلايا الداخلية للجسم الجنيني عن جين oct4 وتحتفظ بتعدد القدرات لمدة 48 ساعة من الزراعة. ومع ذلك، تُعاد هيكلة المزرعة مورفولوجياً إلى طبقة أحادية ظهارية ويبدأ التعبير عن الجينات التي تتحكم في نمو الأديم الظاهر الأولي. بعد ذلك، تبدأ عملية التمايز الخلوي الكامل غير المنظم بظهور أنواع مختلفة من الخلايا المشتقة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. في عملية التمايز التلقائي لخلايا الجسم الجنيني، تكون التجمعات التي تحمل علامات الأديم الباطن على شكل شظايا (أكياس) من الكيس المحي هي أول ما يظهر. ثم تظهر الخلايا الوعائية والخلايا البطانية للشعيرات الدموية النامية في هذه الهياكل. في المراحل الأخيرة من التمايز التلقائي، تتطور خلايا مختلفة متمايزة نهائياً من الخلايا الداخلية للجسم الجنيني، بما في ذلك الخلايا العصبية والعناصر الدبقية وخلايا عضلة القلب والبلعميات وكريات الدم الحمراء. إلى حد ما (مع الأخذ في الاعتبار الانعكاس المكاني لتكوين طبقات الأنسجة الجرثومية)، باستخدام الأجسام الجنينية، من الممكن دراسة العمليات المورفوجينية في المختبر وتحليل الآليات الجزيئية للفترات الأولية للتمايز الخلوي الجنيني،وكذلك تحديد دور الجينات المحددة في تنفيذ هذه العمليات.

وهكذا، يوجد داخل الاستنساخ خلايا تم اكتشاف برامج تطوير وراثية مختلفة فيها - الخلايا الجذعية الجنينية، والأسلاف المبكرة، ومجموعات الأسلاف المتمايزة. إن زراعة الخلايا الجذعية الجنينية عن طريق طريقة القطرة المعلقة أو الزراعة الجماعية بدون طبقة مغذية وبدون إضافة LIF إلى الوسط تؤدي حتمًا إلى تكوين أجسام جنينية. يختلف شكل خلايا الطبقات الخارجية والداخلية للأجسام الجنينية. تتكون الطبقة الخارجية من خلايا كبيرة متفرعة. سطحها المواجه للبيئة مغطى بالعديد من الزغيبات الدقيقة. يتم فصل الطبقة الخارجية من الخلايا عن الطبقة الداخلية بواسطة غشاء قاعدي يشبه غشاء رايخرت، بينما تكون خلايا الطبقة الداخلية للأجسام الجنينية عبارة عن ظهارة أسطوانية. من الناحية الشكلية، على الرغم من احتوائها على العديد من الخلايا المنقسمة، إلا أنها تشبه إلى حد كبير مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة.

خصائص الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

يؤدي غياب التفاعلات الإشارية البرنشيمية-الميزانشيمية، في ظل حجب جينات التوازن الداخلي، إلى اضطراب نمو الخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة، إذ يُعيق ذلك تكوين وتطور البنية التحتية للأعضاء المؤقتة. ويعود النمو غير المنظم والتمايز التلقائي غير المنظم للخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة إلى غياب العلامات الميزانشيمية للهيكل النسيجي للأعضاء المستقبلية: ففي المختبر، من الممكن تمامًا تكوين ملايين الخلايا الكبدية، ولكن من المستحيل الحصول على فصيص كبدي واحد يتضمن عناصر هيكلية ووظيفية مثل الجيوب الأنفية، ومساحات ديس، وخلايا كوبفر.

يُعتقد أن تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية يتحقق حصريًا في مرحلة التخلق الجنيني مع تكوين أنسجة وأعضاء الجنين، بينما المشيمة والحبل السري مشتقان من الأرومة الغاذية. تُنتج الخلايا الجذعية الجنينية المُحاطة بغشاء الأديم الظاهر الغاذي، بالتتابع، نسخًا من الخلايا المؤقتة التي تُنفذ برنامج النمو من خلال الرنا المرسال التوافقي لمصفوفة نوختيوف الطبوغرافية الحجمية، والتي تُحدد مسبقًا الترتيب المكاني والشكل والحجم وعدد خلايا الأعضاء المؤقتة والنهائية، بالإضافة إلى تجميع النسيج الحشوي في وحدات هيكلية ووظيفية. في الوقت نفسه، تظل الخلايا الجذعية الجنينية النوع الوحيد من الخلايا الذي تنفصل فيه الآلية الجزيئية لتنفيذ قدراتها تمامًا عن برنامج النمو الجيني، وتُحرم الخلايا الجذعية الجنينية نفسها من القدرة على التفاعل مع الخلايا الأخرى بسبب حجب كل من إدراكات المستقبلات وأنظمة الإشارات العابرة. ومع ذلك، فإن التنشيط الكافي للخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى تطوير تدريجي لبرنامج التخلق الجنيني، ينتهي بولادة كائن حي مكتمل النمو، يتكون من مليارات الخلايا، جاهز للحياة خارج الرحم. في هذا المسار القصير الأمد، وإن كان طويل الأمد بشكل لا يُصدق، في الفضاء الخلوي، تنشأ أخطاء حتمية في كل من الآليات الجزيئية التي تضمن النشاط الحيوي للخلايا، وفي البرامج التي تتحكم في تكاثرها وتمايزها وتخصصها. لذلك، يُنظر في علم الصيدلة الجيني الحديث إلى أمراض البنية الجزيئية وأمراض برمجة الخلايا بشكل منفصل. علاوة على ذلك، يهدف عمل معظم الأدوية الجديدة إلى تصحيح برامج التمايز والتكاثر وتكوين الأعضاء، بالإضافة إلى تجديد الأعضاء والأنسجة. في الكائن الحي البالغ، تُمكّن الخلايا الجذعية الجنينية من التحكم في سلوك الخلايا الجذعية/السلفية المزروعة في الدماغ والكبد والطحال ونخاع العظم وأعضاء بشرية أخرى، لاستعادة النسيج النسيجي التالف لأعضاء المتلقي عن طريق تمايز خلايا المتبرع وتخصصها على المصفوفة المتوسطة المحفوظة. في جوهره، يبدأ برنامج تكامل القدرات الجينية بالتحقق على مستوى جينومات البويضة والزيجوت والبلاستومير؛ إلا أن هذه الخلايا لم تُستنسخ بعد ولم تُنقل بالكميات اللازمة لتلبية احتياجات الطب التجريبي والعملي. لذلك، تظل الخلايا الجذعية الجنينية مصدرًا فريدًا للمعلومات الجينية، إذ تحتوي على رموز لخريطة ثلاثية الأبعاد للجنين، ورموز للتحديد الخطي لسلالات الخلايا المتخصصة أثناء تكوين المعيدة.

ترجع الإمكانات التجديدية اللامحدودة تقريبًا للخلايا الجذعية الجنينية إلى أن جينومها، على عكس الجهاز الجيني للخلايا الجسدية المتمايزة، يحتفظ بتعدد القدرات. ومن مظاهر حالة الخمول للمعلومات الجينية المضمنة في الخلايا الجذعية الجنينية ما يُسمى بالنمط الظاهري الأدنى - حيث يُعبَّر عن عدد محدود من المستقبلات على سطح الخلايا الجذعية الجنينية، وبالتالي، تُستخدَم برامج إرسال إشارات قليلة جدًا لتفاعل الجهاز النووي للخلية مع بيئتها الدقيقة. وفي ظل سبات الجينات المسؤولة عن تقييد خطوط الخلايا المتخصصة وتمايز الخلايا، يُنشَّط حوالي 30 جينًا فقط من أصل 500 جين، والتي تضمن نواتجها اتصال الخلية بالبيئة الدقيقة المحيطة بها. باستخدام طريقة التحليل التسلسلي للتعبير الجيني، تبين أنه مع العمل المشترك للصناديق الوظيفية الرئيسية للجينوم التي تنظم الطاقة والتمثيل الغذائي في الخلايا الجسدية والخلايا الجذعية الجنينية، فإن الأخيرة لديها مستوى منخفض جدًا من mRNA للمستقبلات والبروتينات G والرسل الثانوية والنسخ والعوامل المساعدة للتعبير والقمع، أي النظام الكامل لنقل الإشارة التنظيمية عبر الغشاء إلى الخلية. ويرجع ذلك إلى غياب أو انخفاض التعبير عن جينات نقل الإشارات. خلال فترة التمايز المستحث في جينوم الخلايا الجذعية الجنينية، يتوقف 18 جينًا عاملاً عن العمل بشكل متزامن على خلفية تنشيط 61 جينًا لنقل الإشارات يتحكم في تخليق مستقبلات التصاق الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية ونسخ التقييد وعناصر الرسل لنظام نقل الإشارة إلى الجهاز النووي من مستقبلات الغشاء البلازمي للخلية. وفي الوقت نفسه، يتم حظر التعبير عن الجينات المسؤولة عن تخليق بروتينات الكاتم، فضلاً عن مثبطات التعبير الجيني المشتركة التي تضمن القدرة الكاملة لجينوم الخلايا الجذعية الجنينية.

عُثر على علامات جينية لخلايا الطبقات الجرثومية الثلاث. يُحدد تحديد طبقة الخلايا الأديمية الظاهرة من خلال التعبير عن جينات العقدة، oct3، وfgf-5، وخلايا الأديم المتوسط من خلال جينات البراتشيوري، وزيتا غلوبين، والأديم الباطن من خلال التعبير عن جين gata-4. في مرحلة التخلق الجنيني الطبيعي، خلال فترة التكوّن المعدي، تُلاحظ هجرة نشطة لمجموعات غير ناضجة من الخلايا الجذعية والسلفية، مما يُحدد موضعيًا مناطق نمو عظام الوجه في الجمجمة، وبعض أجزاء الدماغ، والجهاز العصبي المحيطي، ونظام التوصيل القلبي، والغدة الزعترية، والتي تتكون أنسجتها من مستنسخات الخلايا المهاجرة. يُسهل تحديد الخلايا بواسطة الجينات المبكرة للطبقات الجرثومية مهمة التحليل الطبوغرافي لعمليات هجرة الخلايا السلفية في الجنين النامي. ثبت، على وجه الخصوص، أنه في تجمعات خلايا سرطان الأجنة P19، يبدأ التعبير عن جين الأديم المتوسط الأول، وهو جين براشيور، خلال فترة انخفاض التعبير عن جينات منشط البلازمينوجين النسيجي، ألفا-فيتوبروتين، والكيراتين 8 والكيراتين 19، وهي علامات على أول مجموعات الأديم المتوسط المهاجرة. وبالتالي، لا يبدأ تكوين الأنسجة ذات الأصل المتوسط إلا بعد اكتمال عملية الهجرة النقطية وانتشار الخلايا السلفية المتوسطة.

على الرغم من محدودية السمات الظاهرية وغياب معظم وحدات الإشارة العابرة، لا تزال الخلايا الجذعية الجنينية تُعبّر عن بعض جزيئات المستقبلات التي يمكن استخدامها لتحديد هويتها. يُذكر أن مستضدات علامة الخلايا الجذعية الجنينية شائعة لدى البشر والرئيسيات. في أغلب الأحيان، تُستخدم الأجسام المضادة المُوسومة لمستضدات مرتبطة بالغشاء SSEA-3 وSSEA-4 (مستضدات دهنية فريدة تُمثل مُركبًا من جليكوليبيد GL7 مع حمض السياليك)، بالإضافة إلى بروتينات سكرية عالية البوليمر TRA-1-81 وTRA-1-60، في وسم الخلايا الجذعية الجنينية. بالإضافة إلى ذلك، تُعبّر الخلايا الجذعية الجنينية عن المستضد الجنيني النوعي SSEA-1 والفوسفاتاز القلوي الداخلي، بالإضافة إلى عامل النسخ النوعي Oct4. هذا الأخير ضروري للحفاظ على آليات تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية - حيث يُنشّط عامل النسخ المحدد Oct4 التعبير عن جين عامل نمو الخلايا الليفية 4، ويُثبّت التعبير عن مجموعة الجينات المسؤولة عن تضاعف الحمض النووي غير المحدود في الخلايا غير الناضجة. أهم بروتينات الواسمة داخل الخلايا هي Oct3 وOct4 وTcf وGroucho، وهي مرتبطة ببروتينات كاتم الكروماتين.

بعد سنوات عديدة من محاولات زراعة الخلايا الجذعية الجنينية خارج الجسم، والتي نجحت فيها أولى مزارع الخلايا الجذعية المعزولة من الكيسة الأريمية لدى الفئران ومزارع الخلايا الجرثومية الأولية، بدأت مرحلة من البحث حول الإمكانات المتعددة للخلايا الجذعية الجنينية عند إدخالها إلى الأجنة في مراحل مبكرة من النمو. وقد تبين أنه في مرحلتي التوتة والكيسة الأريمية، تكون الخلايا الجذعية الجنينية قادرة على تكوين أجنة هجينة، حيث تُكتشف سلالات الخلايا الجذعية الجنينية المانحة في جميع الأنسجة الجسدية وحتى في الأمشاج. وهكذا، في علم الأحياء النمائي، وباستخدام الخلايا الجذعية الجنينية، تم ربط الدراسات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر، مما وسّع بشكل كبير إمكانيات دراسة عمليات تكوين الأنسجة والأعضاء الأولية، وتمايزها، وتكوين الأعضاء الجنينية.

من الثابت جليًا أن الخلايا الجذعية الجنينية، أثناء التخلق الجنيني، تندمج في الكتلة الخلوية للجنين في مراحله المبكرة، وتوجد مشتقاتها في جميع الأعضاء والأنسجة. تستعمر الخلايا الجذعية الجنينية سلالة من الخلايا الجرثومية في الجنين الهجين، والتي تُشكل نسلها بويضات وحيوانات منوية كاملة النمو. الخلايا الجذعية الجنينية مستنسخة - أي أن خلية جذعية جنينية واحدة قادرة على تكوين مستعمرة خلايا متطابقة وراثيًا ذات علامات جزيئية، تشمل التعبير عن جين oct4 والفوسفاتاز القلوي، ونشاط التيلوميراز العالي، والتعبير عن بعض المستضدات الجنينية.

لدراسة آليات التكوّن الجنيني باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية، طُوّرت طريقة لتهجين التوتة عن طريق إنشاء بنية بيولوجية، خارجها طبقة من الخلايا البلعمية رباعية الصبغيات للمتلقي، وتُدخل الخلايا الجذعية الجنينية المانحة داخلها. وهكذا، تتكون الأرومة الغاذية من نسل الخلايا البلعمية رباعية الصبغيات للمتلقي، مما يضمن الانغراس والمشيمة، وتعمل الخلايا الجذعية الجنينية المانحة ككتلة خلوية داخلية يتشكل منها جسم جنين قابل للحياة وخط من الخلايا الجرثومية السلفية الأولية. لا تكمن القيمة البحثية للخلايا الجذعية الجنينية في الحفاظ على تعدد القدرات أثناء التلاعب بجينومها في المختبر فحسب، بل تكمن أيضًا في قدرتها على المشاركة في تكوين الخلايا الجرثومية الأولية للجنين الهجين. لقد ثبت أن أحفاد خلية جذعية جنينية معدلة وراثيًا واحدة تُشكل جميع الأساسيات والأنسجة النامية للجنين الهجين الناتج عن تجميع هذه الخلية أو زراعتها مع جنين ثماني خلايا. عند زرع الخلايا الجذعية الجنينية المُحوَّلة بجين البروتين الفلوري الأخضر في توتة الفئران، وُجدت أحفاد فلورية من هذه الخلية في جميع أنسجة الجنين النامي المدروسة (شيمادا، 1999). يسمح زرع الخلايا الجذعية الجنينية في التوتة بتكوين فئران قابلة للحياة يتكون جسمها فقط من أحفاد الخلية الجذعية الجنينية المانحة، مما يفتح آفاقًا لخيارات متنوعة للاستنساخ العلاجي. يُستخدم هذا النهج المنهجي الآن بنجاح لدراسة مشكلات علم الأحياء النمائي، وتحديدًا لتحليل آليات التعطيل الجيني للكروموسوم X أو عدم الاستقرار الجيني للخلايا الجذعية الجنينية. كما يُستخدم زرع الخلايا الجذعية الجنينية في جنين مبكر في التكنولوجيا الحيوية الزراعية، وكذلك في تجارب العلاج الجيني.

يُستخدم زرع الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة وراثيًا لاختبار الخلايا المستهدفة للجينات الطافرة. وتُستخدم الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في المختبر في التكنولوجيا الحيوية لإنتاج فئران معطلة الجين. ولهذا الغرض، يُزال الجين المراد دراسته من الخلايا الجذعية الجنينية عن طريق إعادة التركيب المتماثل (التعطيل)، وتُعزل الخلايا التي تفتقر إلى هذا الجين في أوساط انتقائية. ثم تُدخل الخلايا الجذعية الجنينية المعطلة الجين في الكيسة الأريمية أو تُجمع مع الخلايا الأرومية التوتية. تُزرع الأجنة المبكرة الهجينة التي يتم الحصول عليها بهذه الطريقة في إناث المستقبلات، ويُختار الأفراد الذين لديهم أمشاج خالية من الزيجوت لجين معين من بين الفئران حديثة الولادة. وقد استُخدمت هذه التقنية لإنتاج العديد من سلالات الفئران المعطلة الجين، والتي تُستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء التجريبي والطب التجريبي. وتُستخدم هذه النماذج البيولوجية لدراسة أهمية جينات معينة في التطور الجنيني، بالإضافة إلى دورها في آليات الأمراض البشرية والحالات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم سلالات الحيوانات المعطلة الجين في الاختبارات قبل السريرية لأساليب العلاج الجيني الجديدة. على سبيل المثال، من خلال نقل الأليل الطبيعي لجين متحور إلى جينوم الخلايا الجذعية الجنينية، من الممكن تصحيح طفرة تؤثر على نظام تكوين الدم بشكل فعال. يسمح إدخال الجينات الغريبة في الخلايا الجذعية الجنينية بالتكوين السريع لسلالات من حيوانات المختبر المعدلة وراثيًا متماثلة اللواقح. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تقنية حذف جين إعادة التركيب المستهدف لم تُطور بشكل موثوق حتى الآن إلا فيما يتعلق بالخلايا الجذعية الجنينية للفئران. باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفئران ذات الحذف المزدوج، تم تحديد الدور الوظيفي لمنطقة مجموعة الجينات على الكروموسوم 7 (نسخة من المنطقة الجينومية على الكروموسوم البشري 19) والمنطقة القريبة من الكروموسوم 11 (نسخة من الكروموسوم البشري 5g) - مكّن حذف هذه الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران من تقييم وظيفة نظائرها في البشر.

توسعت إمكانيات دراسة وظيفة جينات التخلق الجنيني البشري، وقد أتاح نقلها إلى جينوم الخلايا الجذعية الجنينية لحيوانات المختبر، على وجه الخصوص، توضيح دور جين الكريبتو في تكوين وتطور الأديم المتوسط القلبي، وهو جين pax-6، في التخلق الجنيني للعين. ويجري حاليًا تجميع الخرائط الأولى للتعبير الجيني في الخلايا الجذعية الجنينية غير الناضجة المتكاثرة في حالات سرطان المسخ وسرطان الأريمية لدى الفئران، كما تم تأكيد فعالية القمع التثبيطي لجينات نقل الإشارات في الخلايا الجذعية الجنينية. ويؤدي مزيج من 60-80 خلية جذعية جنينية متحولة و20-30 خلية من أجنة فئران طبيعية قبل الزرع إلى تطوير أجنة هجينة تتكون فيها البدائيات العضوية من خلايا مانحة ومستقبلة، مما يتيح توضيح دور الجينات المجهولة في تكوين المعدة وتكوين الأعضاء. تم استكمال الخريطة الوظيفية للجينات في أجنة الفئران النامية بمعلومات عن دور جين sf-1 في تكوين الغدة الكظرية والغدد التناسلية، وجين wt-1 في تكوين الكلى، وجينات عائلة myoD في تكوين العضلات الهيكلية، وجينات عائلة gata-1-4 في النضج التقييدي لأساسيات تكون الكريات الحمراء وتكون الخلايا الليمفاوية.

أتاح التعطيل الموجه للأليلات الأمومية والأبوية للجينات في الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام إنزيمات إعادة التركيب النواقل توضيح وظائف جينات مختلفة في المرحلة المبكرة من التخلق الجنيني، كما ساهمت تقنية النقل الموجه للجينات البشرية غير المعروفة إلى الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في اكتشاف جينات طافرة جديدة مسؤولة عن تطور أمراض وراثية شديدة. وباستخدام طريقة الحذف، تم تحديد الأهمية الإلزامية لبعض الجينات في تكوين الأنسجة الجنينية: جين gata-4 لعضلة القلب، وجين gata-1 لسلالة الكريات الحمر في الأنسجة المكونة للدم، وجين myoD للعضلات الهيكلية، وجين brachyury للأديم المتوسط، وجينا النسخ المقيّد hnf3 وhnf4 للخلايا الجذعية الكبدية، وجين rag-2 لتكوين نسائل الخلايا الليمفاوية التائية والبائية (ريبين، 2001). أتاح الحذف المزدوج للجينات في الخلايا الجذعية الجنينية دراسة الدور الوظيفي لجينات الطبقة الجرثومية، والتجزئة، والتماثل الخلوي، كما أتاحت زراعة الخلايا الجذعية الجنينية الحصول على أجنة هجينة قابلة للحياة بين الأنواع. وباستخدام تقنية مُحسّنة لزراعة خلية جذعية جنينية واحدة من متبرع في جنين ثماني الخلايا، تم إثبات حدوث التهجين على المستوى الخلوي للعديد من أعضاء الجنين المتلقي. تجدر الإشارة إلى أنه تم العثور على براعم خلوية من أنسجة بشرية في أعضاء الفئران المتلقية بعد إدخال الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية في الكيسة الأريمية. وقد ثبت أن الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات تدور في دم أجنة الفئران خلال فترة تكوين الأعضاء. ومن المحتمل أن وظيفتها البيولوجية تكمن في التنظيم الجنيني للجهاز المناعي المستقبلي. بمساعدة الخلايا الجذعية الجنينية، أُعيد إنتاج نماذج مناسبة للأمراض الوراثية البشرية في ظروف مختبرية: نُمذج التعطيل المزدوج لجين الديستروفين في ضمور دوشين العضلي لدى الفئران، وتعطيل جين atm (التحكم في تخليق كيناز إشارة الكروماتين) - ترنح توسع الشعيرات الدموية. في هذا المرض الوراثي المميت لدى الأطفال، يتطور انحلال خلايا بوركنجي في المخيخ بسبب عيوب في إصلاح الحمض النووي، ويصاحب ذلك ضمور الغدة الزعترية بسبب موت الخلايا المتكاثرة. تتوافق الصورة السريرية والفيزيولوجيا المرضية والشكل المرضي لترنح توسع الشعيرات الدموية، المُعاد إنتاجه بإدخال معلومات وراثية مرضية في الخلايا الجذعية الجنينية، لدى الفئران الكيميرية مع تلك الموجودة لدى البشر. بالإضافة إلى ترنح توسع الشعيرات الدموية، باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية والفئران المعدلة وراثيًا، تم تطوير نماذج تجريبية لبعض الأمراض البشرية المتماثلة وراثيًا المرتبطة بعلم أمراض التمثيل الغذائي للكربوهيدرات والدهون، وهدم الأحماض الأمينية، وإفراز النحاس والبيليروبين، مما أدى إلى توسيع قدرات الطب التجريبي بشكل كبير في مرحلة الاختبار قبل السريري للطرق الجديدة لعلاج الأمراض البشرية المقابلة.

[ 12 ]، [ 13 ]، [ 14 ]، [ 15 ]

استخدام الخلايا الجذعية الهجينة

تُعدّ الخلايا الهجينة المُنتَجة بدمج الخلايا الجذعية الجنينية مع الخلايا الجسدية نموذجًا مناسبًا وواعدًا لدراسة تعدد قدرات الخلايا الجذعية وإعادة برمجة كروموسومات الخلايا المتمايزة. تُتيح الخلايا الهجينة الخلوية المُنتَجة بدمج الخلايا الجذعية الجنينية مع خلايا متمايزة لحيوان بالغ دراسة العلاقات بين الجينومات من مختلف الأعمار: تنشأ حالة فريدة عندما تتواجد الكروموسومات المتماثلة، القادمة من خلايا في مراحل مختلفة من التمايز ودرجات متفاوتة من النضج، في النواة نفسها، حيث يُمكنها بسهولة تبادل الإشارات التنظيمية المؤثرة. من الصعب التنبؤ بكيفية تفاعل الأنظمة فوق الجينية التنظيمية للكروموسومات المتماثلة، التي تتشكل أثناء النمو الفردي، مع تأثير الإشارات المؤثرة المنطلقة من الجينومات المرتبطة بالجنين. بالإضافة إلى ذلك، يحدث فصل الكروموسومات الأبوية في الخلايا الهجينة، مما يسمح لنا بدراسة تفاعل الجينومات على مستوى الكروموسومات الفردية، أي تحديد مشاركة الكروموسومات المحددة في الحفاظ على تعدد القدرات أو على العكس من ذلك، الخروج إلى التمايز.

استُخدمت الخلايا الهجينة الخلوية الناتجة عن اندماج خلايا سرطانية مسخية متعددة القدرات مع خلايا جسدية متمايزة كأول نموذج تجريبي لدراسة تفاعل الجينومات ذات "تاريخ النمو" المختلف. في بعض الحالات، احتفظت هذه الخلايا الهجينة بخصائص متعددة القدرات بمستوى عالٍ نسبيًا. على وجه الخصوص، حفزت الخلايا الهجينة الناتجة عن سرطانة مسخية-جسدية داخل الجسم الحي نمو أورام مسخية حقيقية تحتوي على مشتقات من الطبقات الجرثومية الثلاث، وفي المختبر، في مزارع معلّقة، شكّلت أجسامًا جنينية. حتى في الخلايا الهجينة الخلوية بين الأنواع من هذا النوع، لوحظ وجود مستضدات جنينية في الحالات التي كان فيها الشركاء الجسديون في الاندماج مع خلايا سرطانة المسخ هم الخلايا الليمفاوية أو الخلايا التيموسية. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا الهجينة الخلوية الناتجة عن اندماج خلايا سرطانة المسخ مع الخلايا الليفية تتوافق مع الخلايا الليفية في النمط الظاهري.

الحقيقة الأكثر أهميةً هي أنه في الخلايا الهجينة السرطانية الجسدية، ظهرت علامات إعادة برمجة جينوم الخلية المتمايزة، والتي اتسمت بإعادة تنشيط إما جينات فردية أو كروموسوم X غير النشط للشريك الجسدي. وبالتالي، تشير نتائج الدراسات على الخلايا الهجينة الخلوية من نوع الخلايا السرطانية الجسدية إلى أن تعدد القدرات غالبًا ما يُحفظ في الخلايا الهجينة، وهناك علامات على إعادة برمجة جينوم الشريك الجسدي.

في تجارب الحصول على خلايا هجينة جنينية داخل النوع عن طريق دمج الخلايا الجذعية الجنينية للفأر مع الخلايا الطحالية البالغة، دُرست خصائص هذه الخلايا الهجينة الخلوية، وحُلل فصل الكروموسومات الأبوية، وقُيِّمت تعدد القدرات الجينية للجينوم الهجين. عادةً ما تتميز الخلايا الهجينة داخل النوع، المُنتَجة عن طريق دمج خلايا سرطان المسخ مع الخلايا الجسدية، بانخفاض مستوى فصل الكروموسومات مع نمط نووي رباعي الصبغيات أو شبه رباعي الصبغيات. ولوحظ تركيب كروموسومي مشابه في الخلايا الهجينة الخلوية أثناء دمج الخلايا الجرثومية الأولية مع الخلايا الليمفاوية. في الوقت نفسه، أظهرت الخلايا الهجينة بين الأنواع، المُنتَجة عن طريق دمج خلايا سرطان المسخ الفأري مع الخلايا الليمفاوية المنكية، فصلاً شديدًا لكروموسومات الشريك الجسدي.

بدأت مرحلة جديدة نوعيًا في دراسة فصل الكروموسومات الأبوية في الهجائن داخل النوع بعد تطوير طريقة لتحليل الميكروساتلايت باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، وبفضل ذلك تم العثور على عدة مئات من العلامات لكل كروموسوم فأر، مما يسمح بالتمييز الموثوق به لأي زوج من الكروموسومات المتجانسة في الخلايا الهجينة.

من خلال دمج الخلايا الجذعية الجنينية (خلايا HM-1 التي تفتقر إلى نشاط هيبوكسانثين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز، 2n = 40، XY، المعزولة من الكيسات الأريمية لفئران 129/01a) مع الخلايا الطحالية لفئران DD/c المتجانسة، أمكن الحصول على مجموعة من الخلايا الهجينة المتشابهة شكليًا مع الخلايا الجذعية الجنينية. عُزلت جميع الخلايا على وسط انتقائي لا تنمو فيه إلا الخلايا التي تحتوي على هيبوكسانثين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز نشط. أظهر التحليل الكهربائي أن جميع الخلايا الهجينة تحتوي على متغير أليلي من هيبوكسانثين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز المميز لفئران DD/c. أظهر التحليل الخلوي الوراثي أن ثلاثة من الخلايا الهجينة الأربعة تحتوي على مجموعة كروموسومات شبه ثنائية الصبغيات. احتوى أحد الخلايا شبه رباعي الصبغيات على مجموعتين من الخلايا الهجينة، إحداهما رباعية الصبغيات والثانية، وهي أصغر حجمًا، ثنائية الصبغيات.

أظهر تحليل الميكروساتلايت، الذي يسمح بالتمييز بين أي زوج من الكروموسومات المتماثلة للفئران 129/01a وDD/c، في النسائل الهجينة ذات المجموعة شبه ثنائية الصيغة الصبغية، وجود إقصاء تفضيلي واضح للصبغيات الجسدية للشريك الجسدي في نسيلتين. حملت معظم الصبغيات الجسدية في النسيلتين HESS2 وHESS3 علامات من سلالة 129/01a، أي الشريك متعدد القدرات. كان الاستثناء هو الكروموسومين 1 و1: ففي النسيلتين HESS2 وHESS3، إلى جانب علامات خلايا HM-1، كانت علامات الشريك الجسدي موجودة بكميات صغيرة. قد تعكس هذه النتائج فصلاً غير مكتمل للكروموسومين 1 و1 للشريك الجسدي، وهي متوافقة مع البيانات الخلوية الوراثية التي تشير إلى وجود تثلث صبغي لهذه الكروموسومات في 30-40% من خلايا النسيلتين HESS2 وHESS3. اختلف مستنسخ HESS4 اختلافًا كبيرًا في تركيبه الكروموسومي: نشأت العديد من الصبغيات الجسدية فيه من جينوم الخلايا الجذعية الجنينية (الكروموسومات 2، 3، 4، 5، 6، 7، 10، 13، 14، و17)، بينما مُثِّلت الكروموسومات 1، 9، 11، 12، 15، 16، 18، و19 بنظائر من كلا الوالدين. كانت النسبة الكمية للكروموسومات الدقيقة التي تُميِّز هذه الكروموسومات المتماثلة حوالي 1:1. سمح هذا للباحثين بافتراض أن أحد النظائر نشأ من جينوم الخلايا الجذعية الجنينية، والآخر من خلايا متمايزة. في بعض الاستنساخات الفرعية من مستنسخ HESS4، لم تظهر سوى علامات الكروموسومين 18 و19 للشريك الجسدي. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أنه في خلايا استنساخ HESS4، بالإضافة إلى فصل كروموسومات الشريك الجسدي، حدث القضاء على واحد أو كلا المتماثلين للكروموسومات المذكورة أعلاه من الجينوم متعدد القدرات، أي كان هناك فصل ثنائي لكروموسومات كلا الوالدين - وهي ظاهرة غير عادية للغاية، حيث أن فصل كروموسومات أحد الوالدين فقط هو سمة من سمات الخلايا الهجينة.

بالإضافة إلى ذلك، بعد المرور العشرين، احتوت جميع استنساخات الخلايا الهجينة على علامات كروموسوم X للشريك الجسدي فقط، أي أن كروموسوم X للخلايا الجذعية الجنينية استُبدل بكروموسوم X للشريك الجسدي في الاستنساخات. وقد تأكدت هذه الحقيقة المهمة من خلال بيانات التهجين الموضعي باستخدام مسبار مُعَلَّم بـ FITC خاص بكروموسوم X للفأر: حيث تم الكشف عن إشارة إيجابية على كروموسوم واحد فقط. وتجدر الإشارة إلى أنه في المراحل المبكرة من الزراعة (قبل المرور الخامس عشر)، ووفقًا للبيانات الخلوية الوراثية، احتوت العديد من الخلايا على كروموسومين X. لذلك، يسمح استخدام الوسائط الانتقائية بالتلاعب بالتركيب الكروموسومي للخلايا الهجينة والاختيار الانتقائي للاستنساخ الذي يحمل كروموسومات مفردة للشريك الجسدي على خلفية جينوم الخلايا الجذعية الجنينية.

بما أن السمة الفريدة للجينوم الخلوي الهجين هي توطين الجينومات الأبوية في نواة واحدة، يُطرح تساؤلٌ طبيعي حول الحفاظ على خصائص تعدد القدرات للجينوم الجنيني في هجائن الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجسدية في ظلّ اتصالها الوثيق بجينوم خلية متمايزة. من الناحية الشكلية، كانت الهجائن الخلوية للخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجسدية مشابهةً لسلالة الخلايا الجذعية الجنينية الأبوية. أظهر تقييم تعدد القدرات أن جميع النسائل ذات مجموعة الكروموسومات شبه ثنائية الصيغة الصبغية كانت قادرة على تكوين أجسام جنينية في مزارع المعلقات، التي تحتوي على مشتقات من ثلاث طبقات جرثومية.

احتوت معظم الخلايا الهجينة على مستضد ECMA-7، وهو علامة مميزة لأجنة الفئران المبكرة، كما تميزت بنشاط عالٍ للفوسفاتاز القلوي. تم الحصول على البيانات الأكثر إقناعًا حول خصائص تعدد القدرات العالية للخلايا الهجينة من تجارب الحصول على سلسلة من الخلايا الهجينة المحقونة التي تتضمن خلايا هجينة من مستنسخ HESS2. أظهر تحليل العلامات الكيميائية الحيوية وجود سلالات الخلايا الهجينة المانحة في معظم أنسجة الخلايا الهجينة. لذلك، تحتفظ الخلايا الهجينة الناتجة عن دمج الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجسدية المتمايزة بتعدد القدرات بمستوى عالٍ، بما في ذلك القدرة على تكوين خلايا هجينة عند حقنها في تجويف الكيسة الأريمية.

اختلفت النسيلتان HESS2 وHESS4 اختلافًا كبيرًا في تركيب الكروموسومات الأبوية، لكنهما امتلكتا خصائص تعدد القدرات متشابهة. يُمكن افتراض أن تعدد القدرات في الجينوم الهجين يظهر كصفة سائدة، ولكن من المحتمل ألا تشارك جميع كروموسومات الجينوم الجنيني في عملية الحفاظ على تعدد القدرات. إذا صحّ هذا الافتراض، يُمكن توقع ألا يُصاحب إزالة بعض كروموسومات الشريك متعدد القدرات من جينوم الخلايا الهجينة تغيير في حالتها التعددية. في هذه الحالة، سيُتيح لنا تحليل فصل الكروموسومات الأبوية في الخلايا الهجينة الجنينية الاقتراب عن كثب من تحديد الكروموسومات المسؤولة عن التحكم في تعدد القدرات في الخلايا الجنينية.

لم يجد O. Serov وآخرون (2001) أي نسل من بين 50 نسلًا تم الحصول عليه عن طريق تهجين الكيميرا مع فئران طبيعية تحمل النمط الجيني 129/01a للفأر وتحمل الكروموسوم X لفئران DD. يعتقد المؤلفون أن هذا يرجع إلى انخفاض في تعدد القدرات في الخلايا الهجينة تحت تأثير الجينوم الجسدي. قد يكون التفسير البديل هو التأثير السلبي للتثلث الصبغي على بعض الصبغيات الجسدية واختلال توازن الكروموسومات الجنسية (لوحظ وجود XXY في الخلايا حتى الممر الخامس عشر) في الخلايا الهجينة أثناء الانقسام الاختزالي. من المعروف أن خلايا XXY غير قادرة على الخضوع للانقسام الاختزالي وتكوين الأمشاج. يمكن أن يسبب التثلث الصبغي أيضًا انخفاضًا في النشاط التكاثري للخلايا الهجينة، ونتيجة لذلك قد تنتمي الميزة الانتقائية في تطور الكيميرا إلى خلايا الجنين المتلقي. ومن ثم، فمن أجل إجراء تقييم مناسب للإمكانات المتعددة القدرات للخلايا الهجينة، من الضروري الحصول على استنساخات هجينة بمجموعة ثنائية الصبغيات طبيعية من الكروموسومات.

في تجارب أو. سيروف وزملائه (2001)، تم إثبات إمكانية إعادة برمجة كروموسوم إكس لخلية جسدية في جينوم الخلايا الهجينة لأول مرة. ينبع هذا الاستنتاج من تحليل التعبير الجيني لجين hprt (علامة كروموسوم إكس) في الخلايا الهجينة: تم الكشف عن وجود المتغير الأليلي لجين hprt لدى فئران DD/c في جميع الأنسجة الهجينة التي تم تحليلها. تجدر الإشارة إلى أنه بعد إدخال الخلايا الهجينة في تجويف الكيسة الأريمية، تصبح الخلايا الهجينة غير انتقائية، وأن الحفاظ على كروموسوم إكس في جينوم الخلايا الهجينة يعني أنه أصبح مكونًا إلزاميًا لها، ولا يميزه الجينوم عن كروموسوم Y للشريك متعدد القدرات.

بتلخيص نتائج تحليل تفاعل الجينومات الجسدية والجينومات متعددة القدرات في الخلايا الجنينية الهجينة، خلص الباحثون إلى أن تعدد القدرات في بعض الخلايا الهجينة الخلوية يتجلى كصفة سائدة. الجينوم الهجين قادر على إعادة برمجة الكروموسومات الفردية للخلايا المتمايزة، إلا أن هذا لا يستبعد إمكانية وجود تأثير عكسي للجينوم الجسدي على تعدد قدرات الجينوم الجنيني. عند زراعة الخلايا الهجينة، يحدث تحريض التمايز بشكل أكثر تواترًا بكثير مما هو عليه في الخط الأبوي الأصلي للخلايا الجذعية الجنينية HM-1. يُلاحظ تأثير مماثل أثناء تكوين المستعمرات الأولية: تتمايز العديد من المستعمرات الأولية للخلايا الهجينة الجنينية في مراحل تكوينها المبكرة مع فقدان كبير للنسخ المستنسخة أثناء اختيارها وتكاثرها.

وهكذا، فإن الخلايا الهجينة الخلوية الناتجة عن اندماج الخلايا الجذعية الجنينية مع الخلايا الجسدية، على الرغم من اتصالها الوثيق بجينوم الخلايا المتمايزة، تحتفظ بتعدد القدرات كخاصية فريدة للجينوم الجنيني. علاوة على ذلك، في مثل هذه الخلايا الهجينة، من الممكن إعادة برمجة الكروموسومات الفردية الناشئة من الخلايا المتمايزة. ولا يزال من غير الواضح إلى أي مدى تحتفظ الخلايا الهجينة بخصائص تعدد القدرات للجينوم الجنيني، ولا سيما قدرتها على المشاركة في تكوين الخط الجرثومي في الخلايا الكيميرية. ويتطلب ذلك الحصول على خلايا هجينة جنينية ذات نمط نووي طبيعي. على أي حال، يمكن أن تصبح الخلايا الهجينة الجنينية متعددة القدرات نموذجًا وراثيًا حقيقيًا لتحديد الكروموسومات المشاركة في الحفاظ على تعدد القدرات أو التحكم فيه، حيث أن الفصل الثنائي للكروموسومات الأبوية قد يوفر هذه الفرصة.

لا تقل جاذبية دراسة الظاهرة التي عرّفها O. Serov وآخرون (2001) باسم "الذاكرة الكروموسومية". في الجينوم الهجين، تكون الكروموسومات المتماثلة في شكلين بديلين: متماثلات الشريك الجسدي خضعت للتمايز في وقت ما، بينما في متماثلات الشريك متعدد القدرات، تكون هذه العملية في بدايتها للتو. وبالتالي، فإن الحفاظ على خصائص متعددة القدرات عالية بواسطة الخلايا الهجينة يشير إلى أن التكوين "متعدد القدرات" لمتماثلات الخلايا الجذعية الجنينية مستقر بدرجة كافية في الجينوم الهجين، على الرغم من تأثير العوامل المؤثرة المنبثقة من الشريك الجسدي. لا تستبعد العلامات الموصوفة أعلاه لإعادة برمجة الكروموسومات المتماثلة للجينوم المتمايز أثناء تطور الكيميرا إمكانية احتفاظها بالوضع الذي اكتسبته أثناء التمايز في الجسم الحي في المراحل الأولى من تكوين وزراعة الخلايا الهجينة الخلوية في المختبر. وفقًا لبيانات حديثة، عند نقل الخلايا الهجينة الجنينية إلى بيئة غير انتقائية، فإنها تُظهر إزالةً مكثفةً لكروموسومات الشريك الجسدي فقط، أي أن جينوم الخلايا الهجينة يُميّز بسهولة بين المتماثلات بعد زراعتها في المختبر لمدة تتراوح بين 10 و15 دورة. وبالتالي، تُمثّل الخلايا الهجينة الجنينية نموذجًا تجريبيًا واعدًا لدراسة خاصية أساسية من خصائص الجينوم الجنيني، وهي تعدد القدرات، بالإضافة إلى بديلها - التمايز الجيني.

الفعالية العلاجية لزراعة الخلايا الجذعية الجنينية

قبل تحليل الفعالية العلاجية لزراعة الخلايا الجذعية الجنينية ومشتقاتها، نلخص ما سبق. قدرات الخلايا الجذعية الجنينية على التنفيذ الكامل للتكوين الجنيني في المختبر غير كافية، لأن عيوب النمو في هذه الحالة ترجع إلى غياب الخلايا الجذعية الوسيطة، التي تنشأ في الجسم بشكل مستقل عن الخلايا الجذعية الجنينية. الإمكانات الجينية للخلايا الجذعية الجنينية أقل من الإمكانات الجينية للزيجوت، ولذلك لا تُستخدم الخلايا الجذعية الجنينية مباشرةً في استنساخ الأجنة. تُستخدم الإمكانات البيولوجية الفريدة للخلايا الجذعية الجنينية، باعتبارها الخلايا الوحيدة التي تُطبّق فيها برامج النمو بشكل كامل ومتسق، في دراسات وظائف الجينات. بمساعدة الخلايا الجذعية الجنينية، تُفكّك التركيبات الأولى من الإشارات التي تُنشّط التعبير عن الجينات المبكرة والمتأخرة التي تُشفّر نمو ثلاث طبقات جرثومية. إن الحفاظ على تعدد قدرات جينوم الخلايا الجذعية الجنينية في المختبر يجعلها أداة فريدة للتجديد الإصلاحي، قادرة على تعويض الخسائر الخلوية تلقائيًا في حالة تلف الأعضاء والأنسجة. في سيناريو افتراضي مثالي، يمكن افتراض أنه "... عند زراعة الخلايا الجذعية الجنينية من المتبرع، يتم نقل البرامج المضغوطة إلى جسم المتلقي، والتي تتحقق في ظل ظروف مواتية في بناء أنسجة جديدة 7، قادرة على "... الاندماج بشكل فعال في جسم المتلقي على المستويين المورفولوجي والوظيفي".

بطبيعة الحال، وبعد تطوير أساليب التمايز الأحادي للخلايا الجذعية الجنينية، بدأت دراسة النشاط الوظيفي للخلايا المُستخلصة من نسيلة متخصصة داخل الجسم الحي. تُولّد نسيلة الخلايا الجذعية الجنينية المتكاثرة مجموعات من الخلايا السلفية المهاجرة القادرة فعليًا على الاندماج بنشاط في مناطق تلف الأنسجة المُستقبلة، وهو ما يُستخدم في الطب التجديدي التجميلي. وقد ثبت أن زرع عصبونات الدوبا في المادة السوداء يُقلل من المظاهر السريرية في حالات شلل الرعاش النصفي التجريبي. كما تُقلل عمليات الزرع الإقليمية للخلايا الجذعية العصبية من المتبرع من درجة الاضطرابات الحركية الناتجة عن صدمات أو كدمات في الحبل الشوكي والدماغ. كما تم الحصول على أولى النتائج الإيجابية لزرع الخلايا الجذعية في أمراض إزالة الميالين. ويبدو أن الإمكانات التجديدية التجميلية للخلايا الجذعية الجنينية تفتح آفاقًا غير محدودة لاستخدام زرع الخلايا في الطب العملي. ومع ذلك، عند زرعها في مناطق خارج الرحم، تتحول الخلايا الجذعية الجنينية حتمًا إلى أورام. تتكون الأورام المسخية عند حقن الخلايا الجذعية الجنينية تحت الجلد في فئران تعاني من نقص المناعة. وعند زرع معلقات الخلايا الجذعية الجنينية تحت كبسولة الخصية في الفئران المتماثلة جينيًا، تتكون أيضًا أورام مسخية تتكون من أنسجة مختلفة، خلاياها مشتقة من الطبقات الجرثومية الثلاث. في مثل هذه الأورام المسخية، تندر عمليات تناقص تكوين الأعضاء بشكل كبير.

يقدم عدد من الدراسات معلومات حول النتائج الإيجابية لزرع مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية المبكرة في حيوانات تعاني من أمراض تجريبية. ويجري تطوير زراعة الخلايا العصبية الخلوية باستخدام مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية في التجارب والتجارب السريرية الأولى لتصحيح الاضطرابات الوظيفية في إصابات الدماغ والنخاع الشوكي، وعلاج تكهف النخاع والتصلب المتعدد (ريبين، 2001). ومع ظهور تقنية التخلق العصبي المختبري من الخلايا الجذعية الجنينية، يجري تطوير أساليب لزرع مشتقات الكرة العصبية المأخوذة من مزارع الأنسجة العصبية الجنينية بدلاً من استخدام أنسجة الدماغ الجنينية. وتتميز معلقات الزرع هذه بتجانسها العالي، وتحتوي على أسلاف ثابتة للخلايا العصبية والدبقية.

مع الإضافة المنتظمة لحمض الريتينويك بجرعة 10 ميكروغرام/مل إلى وسط الزرع لمدة 6 أسابيع، يتكون أكثر من 80% من الخلايا العصبية ما بعد الانقسام الفتيلي في سلالة سرطان الجنين البشري (التشوه) NTERA-2. ويتحقق التجانس الكامل للخلايا العصبية من خلال فرز التدفق للخلايا العصبية الناضجة المصنّفة بعلامات النمط الظاهري المناعي، مما يسمح بالتخلص من بقايا سرطان المسخ والخلايا غير الناضجة. بعد زرعها في مناطق مختلفة من دماغ الحيوانات التجريبية، لا تبقى هذه الخلايا العصبية على قيد الحياة فحسب، بل تندمج أيضًا في الشبكات العصبية الإقليمية. في الحيوانات التي تعاني من نماذج تجريبية لعيوب الجهاز العصبي المركزي الموضعية، يقلل زرع الأعصاب من المظاهر السريرية للأمراض البشرية مثل عواقب إصابات الدماغ الرضحية والسكتة الدماغية وأمراض إزالة الميالين والعيوب الوراثية في نمو المخيخ وأمراض ترسب الدهون والسكريات المتعددة.

لتحسين عمليات التجديد في الأمراض التنكسية للجهاز العصبي المركزي، يجري تطوير تقنيات للحصول على الخلايا قليلة التغصن المنتجة للميالين من الخلايا الجذعية الجنينية. تتضمن المرحلة الأولى عادةً تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية مع تكاثر العدد المطلوب من الخلايا للزراعة. في المرحلة الثانية، يُجرى تمايز الخلايا بشكل مُستهدف إلى مجموعة من أسلاف الخلايا قليلة التغصن المنتجة للميالين، والتي يتم التحكم فيها بواسطة مستضدات واسمة انتقائية.

تلوح في الأفق آفاقٌ لاستخدام مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير أساليب لتصحيح أوجه القصور المناعي الناتجة عن عيوب وراثية في نضج الغدة الزعترية. في دراسات أُجريت على فئران مُعطَّلة (rag 1) مصابة بخلل جيني مُستحث - وهو خلل في آلية إعادة تركيب مواقع V(D)J لجينات مستقبلات الخلايا التائية، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة الخلايا اللمفاوية التائية - يُعيد زرع مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية المبكرة في الغدة الزعترية للحيوانات نضج المجموعات الطبيعية من النسائل المناعية المسؤولة عن المناعة الخلوية. وتُجرى حاليًا تجارب سريرية لزرع الخلايا الجذعية الجنينية المُشكَّلة مُسبقًا في المختبر لعلاج فقر الدم الوراثي المميت لدى الأطفال.

تستند الاعتراضات على الإسراع في إدخال زراعة الخلايا الجذعية إلى العيادات إلى العدد المحدود من سلالات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستقرة، والحاجة إلى توحيد معاييرها. ولزيادة نقاء سلالات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الموحدة، وكذلك الخلايا الجذعية البشرية البالغة، يُقترح استخدام طريقة لاختيار السلالات تعتمد على التحليل الجيني الجزيئي لتكرارات الحمض النووي الترادفية القصيرة. كما يلزم اختبار سلالات الخلايا الجذعية الجنينية للكشف عن أي تغيرات كروموسومية طفيفة وطفرات جينية، والتي يُعدّ احتمال حدوثها في ظروف زراعة الخلايا مرتفعًا للغاية. وتُطرح أطروحة حول الاختبار الإلزامي لخصائص جميع أنواع الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية متعددة القدرات الإقليمية، لأن تكاثرها في المختبر قد يؤدي إلى ظهور خصائص جديدة غير متأصلة في الخلايا الجذعية الجنينية أو الأنسجة النهائية. ويُفترض على وجه الخصوص أن الزراعة طويلة الأمد في بيئات تحتوي على السيتوكينات تُقرّب سلالات الخلايا الجذعية الجنينية من الخلايا السرطانية، نظرًا لخضوعها لتغيرات مماثلة في مسارات تنظيم دورة الخلية مع اكتساب القدرة على إجراء عدد غير محدود من الانقسامات الخلوية. يرى بعض الباحثين، استنادًا إلى احتمالية تطور الأورام، أن زراعة مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية المبكرة في البشر إجراءٌ غير مسؤول. ويرى هؤلاء أن استخدام سلالات الخلايا الجذعية الجنينية المستقرة، أي سلالات الخلايا السلفية المتمايزة، هو الخيار الأكثر أمانًا. ومع ذلك، لم تُطوَّر حتى الآن تقنية موثوقة للحصول على سلالات خلايا بشرية مستقرة تتمايز في الاتجاه المطلوب.

وهكذا، تظهر في الأدبيات العلمية بيانات متزايدة حول التأثير العلاجي الإيجابي لزراعة مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. ومع ذلك، تخضع العديد من هذه الدراسات للمراجعة والنقد. يعتقد بعض الباحثين أن نتائج التجارب السريرية المبكرة أولية بطبيعتها، وتشير فقط إلى قدرة الخلايا الجذعية على ممارسة تأثير إيجابي على المسار السريري لمرض معين. لذلك، من الضروري الحصول على بيانات حول النتائج البعيدة لزراعة الخلايا. ويُستشهد بمراحل تطور زراعة الأعصاب السريرية كحجة. في الواقع، في البداية، سادت المنشورات حول الكفاءة العالية لزراعة شظايا الدماغ الجنينية في مرض باركنسون في الأدبيات، ولكن بعد ذلك بدأت تظهر تقارير تنفي الكفاءة العلاجية للأنسجة العصبية الجنينية أو الجنينية المزروعة في دماغ المرضى.

أُجريت أولى التجارب السريرية لتقييم سلامة زراعة الخلايا الأرومية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية السرطانية المسخية NTERA-2، حيث تكاثرت خلاياها غير الناضجة في المزرعة حتى تراكمت كتلة خلوية قدرها 100 مليون خلية. استُخدمت بعض الخلايا المُستحصلة بهذه الطريقة لتوصيف النمط الظاهري وتحديد الشوائب الخلوية، بالإضافة إلى اختبار احتمالية التلوث بالفيروسات والبكتيريا. أُزيل عامل التحلل الخلوي (LIF) وطبقة التغذية للخلايا السدوية الجنينية من وسط المزرعة، وهُيئت الظروف المناسبة للتمايز المُستهدف للخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا أرومية عصبية باستخدام مزيج من السيتوكينات وعوامل النمو. ثم نُقيت الخلايا الأرومية العصبية من خلايا السرطانية المسخية غير الناضجة باستخدام جهاز فرز الخلايا التدفقي. بعد التنقية الثانوية وتوصيف النمط الظاهري للخلايا المزروعة، حُقن مُعلق من الخلايا العصبية (10-12 مليون) في النواة القاعدية لأدمغة المرضى (في الشهر السابع بعد السكتة الدماغية النزفية) باستخدام قنية دقيقة ومحقنة خاصة، تحت مراقبة التصوير التجسيمي والتصوير المقطعي المحوسب. لم يكشف الفحص الذي أُجري بعد عام واحد لعواقب زرع الخلايا العصبية في منطقة السكتة الدماغية عن أي آثار جانبية أو غير مرغوب فيها. أظهر نصف المرضى تحسنًا في الوظيفة الحركية خلال الفترة من 6 إلى 12 شهرًا بعد الزرع. صاحبت التغيرات السريرية الإيجابية زيادة في تدفق الدم إلى منطقة السكتة الدماغية بعد زرع الخلايا: بلغ متوسط الزيادة في امتصاص 2-ديوكسي جلوكوز المُلوّن بالفلورسنت، وفقًا للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني، 18%، و35% لدى بعض المرضى.

مع ذلك، أجرت المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة دراسة مستقلة حول الفعالية السريرية لزراعة الأعصاب لدى مرضى باركنسون. زُرعت لمرضى المجموعة الأولى أجزاء من أنسجة عصبية جنينية تُنتج الدوبامين، بينما خضعت المجموعة الثانية لعملية جراحية وهمية. تشير النتائج إلى انعدام الفعالية السريرية لمثل هذه الزراعة العصبية، على الرغم من بقاء الخلايا العصبية الجنينية المُنتجة للدوبامين في أدمغة المتلقين. علاوة على ذلك، بعد عامين من زراعة الأنسجة العصبية الجنينية، أصيب 15% من المرضى بخلل حركة مستمر، وهو ما لم يظهر لدى مرضى مجموعة العلاج الوهمي (الخلايا الجذعية: التقدم العلمي وتوجهات البحث المستقبلية. المعهد الوطني للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية). ولا تزال مراقبة تطور المرض لدى هؤلاء المرضى جارية.

يربط بعض المؤلفين البيانات الأدبية المتناقضة حول تقييم الفعالية السريرية لعملية زرع الأعصاب بأساليب مختلفة لاختيار مجموعات المرضى، والاختيار غير الكافي للطرق لتقييم حالتهم بشكل موضوعي، والأهم من ذلك، فترات مختلفة من تطور الأنسجة العصبية الجنينية والمناطق المختلفة من الدماغ التي تم الحصول على هذا النسيج منها، وأحجام زرع مختلفة والسمات المنهجية للتدخل الجراحي.

تجدر الإشارة إلى أن محاولات الزرع المباشر للخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات في منطقة المخطط من دماغ الفئران المصابة بمرض باركنسون النصفي التجريبي قد رافقها تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية وتمايزها إلى خلايا عصبية دوبامينية. ويُفترض أن الخلايا العصبية المُشكّلة حديثًا قد اندمجت بفعالية في الشبكات العصبية، إذ لوحظ بعد زرع الخلايا الجذعية الجنينية تصحيحٌ للتشوهات السلوكية وعدم التناسق الحركي في اختبار الأبومورفين. في الوقت نفسه، نفقت بعض الحيوانات بسبب تحول الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة إلى أورام دماغية.

يعتقد الخبراء من الأكاديميات الوطنية والطبية في الولايات المتحدة الأمريكية، والمتخصصون من المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية، أن الإمكانات السريرية للخلايا الجذعية الجنينية تستحق أكبر قدر من الاهتمام، لكنهم يصرون على ضرورة إجراء دراسة مفصلة لخصائصها، واحتمال حدوث مضاعفات وعواقب طويلة الأمد في التجارب على النماذج البيولوجية المناسبة للأمراض البشرية (الخلايا الجذعية والطب التجديدي المستقبلي، مطبعة الأكاديمية الوطنية؛ الخلايا الجذعية واتجاهات البحث المستقبلية. المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية).

من هذا المنظور، من المهم أن يُظهر التحليل النسيجي المقارن للأورام المسخية التجريبية المُحصّلة عن طريق زرع مُعلّق الخلايا الجذعية الجنينية في الخصية مع الأورام المسخية المُشكّلة نتيجة زرع جنين مُبكر، والذي يحتوي أيضًا على الخلايا الجذعية الجنينية، أن الخلايا الجذعية الجنينية، بغض النظر عن مصدرها الأصلي أو تفاعلها مع بعض الخلايا المحيطة، تُطبّق قدرتها على التسرطن بنفس الطريقة. وقد ثبت أن هذه الأورام المسخية لها أصل استنساخي، حيث يمكن أن تنشأ الأورام المُكوّنة من مُشتقات من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث من خلية جذعية جنينية واحدة (Rega، 2001). يُشار إلى أنه عند زرع الخلايا الجذعية الجنينية المُستنسخة ذات النمط النووي الطبيعي في فئران مُصابة بنقص المناعة، تكوّنت أيضًا أورام مسخية تتكون من أنواع مُختلفة من الخلايا الجسدية المُتمايزة. تُعدّ هذه البيانات التجريبية دليلاً قاطعًا على الأصل الاستنساخي للأورام المسخية. من وجهة نظر علم الأحياء النمائي، تشير هذه الدراسات إلى أن خلية جذعية متعددة القدرات، وليست خلايا سلفية ملتزمة متعددة، هي مصدر المشتقات المتمايزة لجميع الطبقات الجرثومية الثلاث التي تُشكل الورم المسخي. ومع ذلك، في الطريق إلى زراعة الخلايا عمليًا، تُعتبر نتائج هذه الدراسات، إن لم تكن مُحظورة، فهي تحذير من خطر مُحتمل، لأن تلقيح الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجرثومية البدائية في أنسجة مُختلفة من فئران بالغة مُصابة بنقص المناعة يُؤدي حتمًا إلى تطور أورام من الخلايا الجذعية المزروعة. يصاحب التنكس الورمي للخلايا الجذعية الجنينية المزروعة خارج الرحم ظهور مجموعات فرعية من الخلايا المتمايزة - بسبب التمايز الجزئي للخلايا الجذعية الجنينية ونسائل السلف إلى سلالات مُتخصصة. ومن المثير للاهتمام أنه عند زراعة الخلايا الجذعية الجنينية في العضلات الهيكلية، غالبًا ما تتشكل الخلايا العصبية بجوار خلايا السرطان المسخي. ومع ذلك، فإن إدخال الخلايا الجذعية الجنينية في بويضة مقسمة أو كيسة أريمية يصاحبه اندماج كامل للخلايا في الجنين دون تكوين عناصر ورمية. في هذه الحالة، تندمج الخلايا الجذعية الجنينية في جميع أعضاء وأنسجة الجنين تقريبًا، بما في ذلك البدائية التناسلية. تم الحصول على هذه الحيوانات الألوفينية لأول مرة عن طريق إدخال خلايا سرطانية مسخي 129 في أجنة مبكرة في مراحل 8-100 خلية. في فئران الألوفينية، تندمج مجموعات من الخلايا غير المتجانسة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية المانحة في أنسجة نخاع العظم والأمعاء والجلد والكبد والأعضاء التناسلية، مما يجعل من الممكن إنتاج خلايا كيميرية بين الأنواع في التجربة. كلما قصرت فترة نمو الجنين المبكر، زادت نسبة التهجين الخلوي، مع أعلى درجة من التهجين الملحوظ في الجهاز المكون للدم والجلد والجهاز العصبي والكبد والأمعاء الدقيقة لجنين الألوفين. في الكائن الحي البالغ، تكون الأنسجة المحمية من الجهاز المناعي للمتلقي بواسطة الحواجز الهيستودمائية عرضة للتكاثر الخلوي:يصاحب زرع الخلايا الجرثومية الأولية في نسيج الخصية دمج الخلايا الجذعية المتبرع بها في طبقة النسيج الجرثومي للمتلقي. ومع ذلك، عند زرع الخلايا الجذعية الجنينية في الكيسة الأريمية، لا يحدث تكوين أساسيات هجينة للأعضاء التناسلية مع تكوين الخلايا الجرثومية الأولية المتبرع بها. يمكن أيضًا استخدام تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية، عند تهيئة ظروف خاصة، للاستنساخ: زرع الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في جنين فأر يتكون من 8 إلى 16 خلية، حيث يتم حجب الانقسام الخلوي بواسطة السيتوكالسين، يعزز حدوث التخلق الجنيني الطبيعي مع نمو جنين من الخلايا الجذعية الجنينية المتبرع بها.

لذلك، يُعدّ الاستنساخ العلاجي بديلاً لزراعة الخلايا الجذعية الجنينية الخيفية، ويعتمد على زرع نوى الخلايا الجسدية في بويضة منزوعة النواة لتكوين الكيسة الأريمية، حيث تُعزل من الكتلة الخلوية الداخلية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية المتطابقة وراثيًا مع مانحة النواة الجسدية. من الناحية التقنية، تُعدّ هذه الفكرة ممكنة تمامًا، حيث أُثبتت مرارًا وتكرارًا إمكانية إنتاج خطوط الخلايا الجذعية الجنينية من الكيسات الأريمية المُحصّلة بعد زرع النوى الجسدية في بويضات منزوعة النواة في تجارب أُجريت على حيوانات المختبر (ناجي، ١٩٩٠؛ مونسي، ٢٠٠٠). وعلى وجه الخصوص، في الفئران متماثلة اللواقح لطفرة جين rag2، استُخدمت الخلايا الليفية المُحصّلة عن طريق زراعة خلايا الأنسجة تحت البشرة كمُتبرعات للنوى، والتي زُرعت في بويضات منزوعة النواة. بعد تنشيط البويضة، زُرعت "الزيجوت" حتى تكوّن الكيسة الأريمية، حيث عُزلت الخلايا الجذعية الجنينية من الكتلة الخلوية الداخلية ونُقلت إلى سلالة من الخلايا عديمة الزيجوت للجين الطافر (rag2~/~). صُحّحت طفرة أحد الجينات الأليليات في هذه الخلايا بطريقة إعادة التركيب المتماثل. في السلسلة الأولى من التجارب، تم الحصول على أجسام جنينية من الخلايا الجذعية الجنينية ذات الجين المُعاد تركيبه، وحُوِّلت خلاياها بفيروس رجعي مُعاد التركيب (HoxB4i/GFP)، وبعد التكاثر، حُقنت في وريد فئران rag2~/~. في السلسلة الثانية، جُمعت الخلايا البلاستومرية رباعية الصيغة الصبغية مع الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة وراثيًا، وزُرعت في إناث مُستقبلة. عملت الفئران ذات المناعة الكافية كمتبرعات لنخاع العظم لزراعته في فئران طافرة rag2~/~. في كلتا السلسلتين، كانت النتيجة إيجابية: بعد 3-4 أسابيع، وُجدت خلايا نخاعية ولمفاوية ناضجة طبيعية قادرة على إنتاج الغلوبولينات المناعية في جميع الفئران. وبالتالي، يمكن استخدام زرع نوى الخلايا الجسدية في البويضات ليس فقط للحصول على سلالات الخلايا الجذعية الجنينية، ولكن أيضًا للعلاج الجيني الخلوي - تصحيح التشوهات الوراثية، باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية كناقل لنقل المعلومات الجينية التصحيحية. إلا أن هذا التوجه لزرع الخلايا، بالإضافة إلى المشكلات الأخلاقية الحيوية، له حدوده. فمن غير الواضح مدى أمان زرع الخلايا المستنسخة علاجيًا ذات النمط الجيني المطابق للنمط الجيني لمريض معين، لأن هذه الخلايا قد تُدخل طفرات تُسبب استعدادًا لأمراض أخرى. تظل البويضات البشرية الطبيعية مادة يصعب الحصول عليها، بينما حتى مع زرع النوى الجسدية في بويضات حيوانية منزوعة النواة، فإن 15-25% فقط من "الزيجوتات" المُصنّعة تتطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية. لم يُحدَّد بعد عدد الكيسات الأريمية اللازمة للحصول على سلالة واحدة من الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات المستنسخة. وتجدر الإشارة أيضًا إلى التكلفة المالية المرتفعة المرتبطة بتعقيد منهجية الاستنساخ العلاجي.

في الختام، تجدر الإشارة إلى أنه في الخلايا الجذعية الجنينية، تجتمع تعدد القدرات الجينية مع نقص الحمض النووي الميثيلي مع نشاط التيلوميراز العالي وطور C^ قصير من دورة الخلية، مما يضمن تكاثرها المكثف واللامتناهي المحتمل، حيث تحتفظ الخلايا الجذعية الجنينية خلاله بمجموعة ثنائية الصيغة الصبغية من الكروموسومات ومجموعة "شبابية" من الخصائص الظاهرية. لا يتعارض النمو النسيلي للخلايا الجذعية الجنينية في المزرعة مع تمايزها إلى أي سلالة خلوية متخصصة في الكائن الحي عند إيقاف التكاثر وإضافة إشارات تنظيمية مناسبة. يتحقق تمايز الخلايا الجذعية الجنينية المقيدة إلى سلالات خلوية جسدية في المختبر دون مشاركة اللحمة المتوسطة، متجاوزةً بذلك نوشتيز، وخارج عملية تكوين الأعضاء، ودون تكوين الأجنة. يؤدي الإدخال غير الطبيعي للخلايا الجذعية الجنينية في الجسم الحي حتمًا إلى تكوين سرطانات مسخية. يصاحب زرع الخلايا الجذعية الجنينية في الكيسة الأريمية أو الجنين المبكر اندماجها مع الأنسجة الجنينية وتكوين أعضائها بشكل مستقر.

تُشكّل تقنيات التجديد البلاستيكي القائمة على زراعة الخلايا محور اهتمام علماء بيولوجيا الخلية، وعلم الأحياء التنموي، وعلم الوراثة التجريبي، وعلم المناعة، وعلم الأعصاب، وأمراض القلب، وأمراض الدم، والعديد من فروع الطب التجريبي والعملي الأخرى. تُثبت أهم نتائج الدراسات التجريبية إمكانية إعادة برمجة الخلايا الجذعية بتغيير مُستهدف في خصائصها، مما يفتح آفاقًا للتحكم في عمليات التمايز الخلوي باستخدام عوامل النمو - لتجديد عضلة القلب، واستعادة آفات الجهاز العصبي المركزي، وتطبيع وظيفة جهاز جزر البنكرياس. ومع ذلك، ولتوسيع نطاق زراعة مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية في الطب العملي، من الضروري دراسة خصائص الخلايا الجذعية البشرية بمزيد من التفصيل، ومواصلة التجارب عليها على نماذج الأمراض التجريبية.

يمكن حل القضايا الأخلاقية الحيوية ومشكلة رفض زراعة الخلايا الخيفية من خلال اللدونة المكتشفة لجينوم الخلايا الجذعية الإقليمية للكائن البالغ. ومع ذلك، فإن المعلومات الأولية التي تفيد بأنه عند زرع خلايا ذاتية مكونة للدم معزولة ومُميزة بدقة في الكبد، والتي تُشتق منها خلايا كبدية جديدة، وتندمج في فصيصات الكبد، تخضع الآن للمراجعة والنقد. ومع ذلك، فقد نُشرت بيانات تفيد بأن زرع الخلايا الجذعية العصبية في الغدة الزعترية يُسبب تكوين براعم جديدة من الخلايا الليمفاوية التائية والبائية من المتبرع، وأن زرع الخلايا الجذعية العصبية الدماغية في نخاع العظم يُؤدي إلى تكوين براعم مكونة للدم مع تكون النخاع والكريات الحمراء من المتبرع على المدى الطويل. وبالتالي، يمكن للخلايا الجذعية متعددة القدرات القادرة على إعادة برمجة الجينوم إلى إمكانات الخلايا الجذعية الجنينية أن تستمر في أعضاء الكائن البالغ.

يظل الجنين البشري مصدر الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية للأغراض الطبية، وهو ما يُحدد مسبقًا حتمية تقاطع جديد بين القضايا الأخلاقية والقانونية والدينية عند نقطة نشأة الحياة البشرية. وقد أعطى اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية زخمًا قويًا لاستئناف المناقشات الحادة حول الخط الفاصل بين الخلايا الحية والمادة، والوجود والشخصية. في الوقت نفسه، لا توجد معايير وقواعد وقوانين عالمية بشأن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية في الطب، على الرغم من المحاولات المتكررة لوضعها واعتمادها. كل دولة، في إطار تشريعاتها، تحل هذه المشكلة بشكل مستقل. من جانبهم، يواصل الأطباء حول العالم محاولة تجاوز نطاق هذه المناقشات في مجال الطب التجديدي البلاستيكي، وذلك في المقام الأول من خلال استخدام احتياطيات الخلايا الجذعية البالغة بدلاً من الخلايا الجذعية الجنينية.

نبذة مختصرة عن تاريخ عزل الخلايا الجذعية الجنينية

عُزلت خلايا سرطانة الأجنة المسخية من أورام مسخية خصوية تلقائية لدى فئران 129/ter-Sv، وأورام مسخية مبيضية تلقائية لدى فئران Lt/Sv، ومن أورام مسخية مشتقة من خلايا أو أنسجة جنينية مزروعة خارج الرحم. من بين سلالات خلايا سرطانة الأجنة المستقرة لدى الفئران التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة، كان بعضها متعدد القدرات، بينما تميز بعضها الآخر بنوع خلوي واحد محدد فقط، وكان بعضها الآخر عاجزًا تمامًا عن التمايز الخلوي.

في وقت ما، كان التركيز على الدراسات التي أشارت نتائجها إلى إمكانية إعادة خلايا السرطان (الجنين) إلى النمط الظاهري الطبيعي بعد إدخالها في أنسجة الجنين النامي، فضلاً عن العمل على إنشاء خلايا سرطان (جنين) معدلة وراثيًا في المختبر، والتي تم بمساعدة الفئران المتحولة للنمذجة البيولوجية للأمراض الوراثية البشرية.

استُخدمت زراعة المعلقات المشروطة لعزل سلالات خلايا سرطانية مشوهة (جنينية). في المزرعة، تنمو خلايا سرطانية مشوهة (جنينية)، مثل الخلايا الجذعية الجنينية، لتكوين أجسام جنينية، وتتطلب تفككًا إلزاميًا لنقل السلالة، مما يحافظ على تعدد القدرات على طبقة تغذية من الخلايا الليفية الجنينية أو أثناء زراعة المعلقات في وسط مُكيف. تتميز خلايا سلالات سرطانية مشوهة (جنينية) متعددة القدرات بأنها كبيرة وكروية الشكل، وتتميز بنشاط عالٍ للفوسفاتاز القلوي، وتشكل تكتلات، وهي قادرة على التمايز متعدد الاتجاهات. عند إدخالها في الكيسة الأريمية، تتجمع مع التوتة، مما يؤدي إلى تكوين أجنة هجينة، في تكوين أعضاء وأنسجة مختلفة توجد فيها مشتقات من خلايا سرطانية مشوهة (جنينية). مع ذلك، تموت الغالبية العظمى من هذه الأجنة الكيميرية داخل الرحم، ونادرًا ما تُكتشف الخلايا الغريبة في أعضاء الأجنة الكيميرية حديثة الولادة الناجية، وتكون كثافتها منخفضة. في الوقت نفسه، يزداد معدل الإصابة بالأورام (الساركوما الليفية، والساركوما العضلية المخططة، وأنواع أخرى من الأورام الخبيثة، وورم البنكرياس الغدي) بشكل حاد، وغالبًا ما يحدث تنكس الورم خلال فترة نمو الأجنة الكيميرية داخل الرحم.

تكتسب معظم خلايا سرطان الجنين (الجنين) المسخي في البيئة الدقيقة للخلايا الجنينية الطبيعية خصائص ورمية خبيثة بشكل شبه طبيعي. يُعتقد أن الخباثة غير القابلة للعكس ترجع إلى تنشيط الجينات الأولية المسرطنة في عملية إعادة ترتيب الهياكل. أحد الاستثناءات هو خلايا خط سرطان الجنين SST3، المأخوذة من أورام خصوية الفأر المسخي (الخط 129/Sv-ter)، والتي تُظهر قدرة عالية على الاندماج في أنسجة وأعضاء الجنين دون تكوين ورم لاحقًا في الفئران الكيمرية. لا تشارك مشتقات خطوط خلايا سرطان الجنين (الجنين) المسخي في الفئران الكيمرية عمليًا في تكوين الخلايا الصبغية الأولية. يبدو أن هذا يرجع إلى ارتفاع وتيرة الانحرافات الكروموسومية المميزة لمعظم خطوط سرطان الجنين (الجنين)، حيث يُلاحظ في خلاياها كل من اختلال الصيغة الصبغية والتشوهات الكروموسومية.

تم الحصول على عدة سلالات مستقرة من خلايا سرطان الجنين البشري المسوخ (الجنين) تتميز بتعدد القدرات والنشاط التكاثري العالي والقدرة على التمايز أثناء النمو في المزارع في ظروف معملية. على وجه الخصوص، تم استخدام سلالة خلايا سرطان الجنين البشري المسوخ (الجنين) NTERA-2 لدراسة آليات التمايز الخلوي العصبي. بعد زرع خلايا هذا الخط في المنطقة تحت البطينية من الدماغ الأمامي للفئران حديثة الولادة، لوحظ هجرتها وتكوينها العصبي. بُذلت محاولات لزرع الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها عن طريق زراعة خلايا سلالة سرطان الجنين المسوخ (الجنين) NTERA-2 لمرضى السكتات الدماغية، مما أدى، وفقًا للمؤلفين، إلى تحسن في المسار السريري للمرض. في الوقت نفسه، لم تكن هناك حالات خباثة لخلايا سرطان الجنين المسوخ المزروعة NTERA-2 لدى مرضى السكتة الدماغية.

تم الحصول على أولى سلالات الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات غير المتمايزة للفأر في أوائل ثمانينيات القرن العشرين بواسطة إيفانز ومارتن، حيث عزلاها من الكتلة الخلوية الداخلية للكيسة الأريمية - الأرومات الجنينية. احتفظت سلالات الخلايا الجذعية الجنينية المعزولة بتعدد قدراتها وقدرتها على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا تحت تأثير عوامل في وسط زراعة خاص لفترة طويلة.

يعود مصطلح "الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات" إلى ليروي ستيفنز، الذي لفت الانتباه، أثناء دراسته لتأثير قطران التبغ على معدل تطور الورم، إلى الظهور التلقائي لسرطانة المسخ الخصوية لدى فئران خطية (129/v) من المجموعة الضابطة. اتسمت خلايا سرطانة المسخ الخصوية بمعدل تكاثر مرتفع، وفي وجود سائل من تجويف البطن، تمايزت تلقائيًا مع تكوين الخلايا العصبية، والخلايا الكيراتينية، والخلايا الغضروفية، وخلايا عضلة القلب، بالإضافة إلى شظايا الشعر والعظام، ولكن دون أي علامات على بنية خلوية منظمة للأنسجة المقابلة. عند وضعها في المزرعة، نمت خلايا سرطانة المسخ كنسخ متعددة القدرات غير متصلة بالركيزة وشكلت أجسامًا جنينية، وبعد ذلك توقفت عن الانقسام وخضعت لتمايز عشوائي تلقائي إلى خلايا عصبية، وخلايا دبقية، وخلايا عضلية، وخلايا عضلة القلب. وجد ستيفنز أن سرطانة الفأر المسخية 129/v تحتوي على أقل من 1% من الخلايا القادرة على التمايز إلى سلالات جسدية متخصصة متنوعة، وأن التمايز نفسه يعتمد على العوامل المؤثرة عليها (تركيب السائل البريتوني، أو نواتج الخلايا الناضجة، أو الأنسجة المضافة إلى المزرعة). وقد تأكدت فرضية ليروي ستيفنسون حول وجود خلايا سلفية جنينية من السلالة الجرثومية بين خلايا سرطانة المسخ: إذ أدى تعليق خلايا الأرومات الجنينية من أجنة ما قبل الزرع في أنسجة فئران بالغة إلى تكوين سرطانات مسخية، وتمايزت سلالات الخلايا النقية المعزولة منها بعد حقنها داخل الصفاق في الحيوانات المتلقية إلى خلايا عصبية، وخلايا عضلية قلبية، وخلايا جسدية أخرى مستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث. في التجارب التي أُجريت داخل الجسم الحي، أدى زرع الخلايا الجذعية الجنينية (المأخوذة من الأرومة الجنينية، وليس الأرومة الغاذية) في أجنة فئران من سلالة أخرى في المراحل 8-32 من البلاستومير إلى ولادة حيوانات هجينة (دون تطور أورام)، وُجدت في أعضائها براعم من أنسجة المتبرع. ولوحظت ظاهرة التهجين حتى في سلالة الخلايا الجرثومية.

تطابقت الخلايا الجرثومية السلفية الأولية المعزولة من البدائية التناسلية لجنين فأر، من حيث الشكل والنمط المناعي والخصائص الوظيفية، مع الخلايا الجذعية الجنينية التي حصل عليها ستيفنسون من سرطانة المسخ والأرومة الجنينية. في الكيميرا المولودة بعد إدخال الخلايا الجذعية الجنينية في الكيسة الأريمية، اتسم التكوين الجيني للأعضاء بتناوب فسيفسائي بين الوحدات الهيكلية والوظيفية للكبد والرئتين والكلى لدى المتبرع والمتلقي. في بعض الحالات، لوحظ تكوين خبايا معوية أو فصيصات كبدية تتكون من خلايا المتلقي والمتبرع. ومع ذلك، كان التكوين الجيني دائمًا يتم وفقًا للبرنامج الجيني للنوع الذي ينتمي إليه المتلقي، واقتصرت الكيميرية على المستوى الخلوي فقط.

ثم ثبت أن تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية دون تمايز خلوي على طبقة مغذية من الخلايا المشتقة من اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية الجنينية) يحدث مع الوجود الإلزامي لـ LIF في بيئات غذائية انتقائية، مما يضمن بشكل انتقائي بقاء الخلايا الجذعية والسلفية فقط، بينما تموت الغالبية العظمى من العناصر الخلوية المتخصصة. باستخدام هذه الأساليب، في عام 1998، عزل جيمس طومسون خمسة خطوط خالدة من الخلايا الجذعية الجنينية من الكتلة الخلوية الداخلية لكيسة أريمية بشرية. في العام نفسه، طور جون جيرهارت طريقة لعزل خطوط الخلايا الجذعية الجنينية الخالدة من الدرنة التناسلية لأجنة بشرية تتراوح أعمارها بين أربعة وخمسة أسابيع. نظرًا لخصائصها الفريدة، بدأ بعد عامين فقط استخدام الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية للأنسجة النهائية في ممارسة الطب التجديدي والعلاج الجيني.