الخلايا الجذعية الجنينية

اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية - لم يكن هناك أي حادث، وظهر على ابحاث التربة مستعد في مجال البحوث البيولوجيا التطورية. تم إدخال مصطلح "الخلية الجذعية" في الطب إلى عام 1908 في مؤتمر المجتمع الدموي في برلين من قبل ألكسندر ماكسيموف فيما يتعلق بالخلايا المكونة للدم. قبل فترة طويلة من العزلة وإعداد خطوط مستقرة للخلايا الجذعية الجنينية المحفزة في التنمية في وقت مبكر من عملية البحث المستخدمة المسخ الجذعية (خلايا الجنين-سرطان الذي درس آليات غير معروفة من التطور الجنيني، بما في ذلك سلسلة من التعبير عن الجينات في وقت مبكر ومنتجات البروتين عملهم.

ولكن هل تعدد الجينوم البشري خاسر بشكل لا يمكن إصلاحه في عملية التطور؟ لا ، والتثليم الجنيني هو دليل. إذا كان الأمر كذلك ، فعندئذ ، متى ، من حيث المبدأ ، سيتم تحقيق المسار الثاني للتنمية التطورية؟ على الأرجح ، عندما يغادر الشخص الكون ، حيث تكون الظروف البيئية ثابتة نسبيا لفترة طويلة. يمكن اعتبار فقدان العظام (التنقيه العظام في حالة انعدام الوزن) إعادة جدا قابلة ببطء وتجديد كخطوة أولى لعملية التكيف الإنسان كنوع من وجودها في الفضاء. ومع ذلك ، فإن الدفع للمسار الثاني من التطور التطوري سيكون مختلفًا ، حيث سيكون العقم هو الثمن الذي يجب دفعه لكل خلايا التوتّر واللدونة المطلقة. حتى تضاعف في هذا العالم من "الحرباء التطورية" لن يكون هناك أي انقسام ، otpochkovaniem. لكننا سنعيش طويلا. خلود التيلوميراز هو خلود الأميبا. في الكائنات متعددة الخلايا ، والخلايا الجذعية هي الركيزة من طول العمر النوعي والكمي.

[1], [2], [3], [4]

مصادر الخلايا الجذعية الجنينية

مصادر اليوم من الخلايا الجذعية الجنينية لاجراء اختبارات معملية هي الخط الفئران سرطانة مسخية (129 / SV، F19، F8، زين 40، CGR 86، RL، CCE، JM-1، E14TG2a، CGRSb) وسرطانة مسخية البشري (NTERA-2، TERA-2 ، استنساخ H-9) ، فضلا عن خطوط ESC Trauneone. ومع ذلك، فإن وجود مفصلة جواز سفر الخلوي مشيرا إلى النمط الظاهري المناعي، ونتائج التحليل الصبغي من ملامح التعبير مرنا تتعرض مستقبلات البروتين والإشارات بين الخلايا لا تعوض عن عيوب كبيرة teratokartsinomnyh خطوط ESC - فقدان سريع لشمول الوسع واستحالة التطبيق في التجارب السريرية، والتمايز المختلط في الثقافة هي صعبة جدا لعزل خط متخصص نقي من مجموعة غير متجانسة من الخلايا. لذلك، عادة ما يكون مصدر خطوط ESC أنتجت لأغراض سريرية، بمثابة الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة والأجنة عن Blastomeres الفردية للمرحلة 8 خلايا للتنمية، وخلايا تويتة مراحل لاحقة، والخلية الجرثومية الأولية.

تجدر الإشارة إلى أن خلايا teratocarcinoma ، على الرغم من أنها تمتلك خاصية تعدد القدرات ، وتتميز بقدرتها أقل بكثير من القدرات متعددة القدرات مقارنة مع ESC. ونادرًا ما يؤدي تكاملها مع الخلايا الجنينية إلى تكوين الكيميرات ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأمشاج ذات النمط الوراثي لخلايا teratocarcinoma لا تتشكل أبدًا. ويعتقد أن هذا يرجع إلى الظهور المتكرر للخلل في الكروموسومات في زراعة خلايا teratocarcin: فقدان الكروموسوم Y ، مختلف trisomy ، الحذف أو translocations.

وقد أجريت محاولات للتمييز بين خط ESC البشري عدة مرات ، ولكن هذه المهمة لا يمكن حلها ، حيث أن الكيسات البشرية العادية يصعب الوصول إليها. بالإضافة إلى ذلك ، في البشر ، فإن وتيرة الشذوذ الكروموسومات أعلى مما كانت عليه في مرحلة التطور الجنيني للحيوانات. الغالبية العظمى من الأجنة البشرية المبكرة التي تم الحصول عليها بعد التخصيب في المختبر تظهر فسيفساء الكروموسومات الفوضوية وغالبا ما تكون هناك انحرافات عددية وهيكلية. حتى في وقت لاحق ، في مرحلة الكيسة الأريمية ، تتكون فقط 20-25 ٪ من الأجنة البشرية من الخلايا ذات النمط النووي العادي. كان من شبه المستحيل استخدام مثل هذه الأجنة لإنشاء ESC ، حيث كانت الزرقبات عادة تربيتها لمراحل اثنين أو أربعة blastomeres ومن ثم زرعت في الرحم. فقط في الآونة الأخيرة نسبيا كانت تقنية موثوقة وضعت لزراعة البويضات البشرية المخصبة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. لم يؤد إدخال هذه التقنية إلى ممارسة الإخصاب في المختبر إلى زيادة تكرار نتائج عملية الزراعة الناجحة فحسب ، بل أدى أيضًا إلى جعل الأجسام الكيسة الطبيعية كائنًا يسهل الوصول إليه.

مصدر الخلايا الجذعية المحفزة آخر هو الخلايا الجنسية الأولية، والتي، على النقيض من السكان السلف أكثر تقدما germenativnogo ظهارة، ليست على سطح بيتا إنتغرين، ولكن التعبير عن النشاط العالي shelochnoy الفوسفاتيز. وتجدر الإشارة إلى أنه في التجربة ، تم دراسة عدد الخلايا الجذعية ، التي تكونت من الخلايا الجنسية الأولية ، منذ الثمانينيات من القرن الماضي. في الوقت نفسه ، تم تطوير تقنية لعزل الخلايا الجرثومية الأولية من بقايا جنين فأر الجنين. أول نتائج غير ناجحة من زراعة الخلايا الجرثومية الأولية في المختبر تشير إلى اليأس من هذه المحاولات ، لأن الخلايا ، على الرغم من أنها نجت ، لم تتكاثر ومات في غضون ال 24 ساعة الأولى. في وقت لاحق تم العثور على أن الخلايا الجرثومية الأولية في الفئران تتكاثر في المختبر فقط في وجود عوامل نمو محددة متعددة البيبتيد قابلة للذوبان وغشاء محددة في وسط الثقافة. أشارت نتائج العديد من الدراسات إلى أن بقاء وانتشار خلايا جرثومية أولية يتطلب وجودها في وسط الاستزراع ليس فقط في LIF ، بل أيضا غشاء محدد ، وكذلك عوامل فولاذية قابلة للذوبان (SIF). يتم إنتاج هذه الببتيدات عن طريق الخلايا الجسدية للأجنة متماثلة الزيجوت لطفرة الصلب ، وأحدها هو عبارة عن رابطة من cKit البروتيني.

الخلايا الجذعية الأولية للثدييات والبشر هي من أصل extragonadal وهي مصدر التطور النسيلي لخط الخلية الجنسية. إن بداية خط الخلية الجرثومية الأولية ، وكذلك جميع أنسجة الجنين ، وكذلك الأديم المتوسط الخارج عن النطاق ، تعطي الأديم الظاهر (الأديم الظاهر الأولي) للأجنة المبكرة ، التي لديها تنظيم بنيوي فسيفساء. أنشأت إزالة المجهرية المجهرية لأجزاء مختلفة من الجنين المبكر منطقة توطين في الأديم الظاهر من استنساخ لسلائف ملتزمة للخلايا الجرثومية الأولية. مع مساعدة من رودامين ديكستران ، والتي كانت تستخدم كعلامة الخلية ، ثبت أن السلائف من الخلايا الجنسية الأولية تقع في المنطقة الأديم الظاهر القريبة ، بجانب الأديم الظاهر الجنينية. ينبثق خط الخلية الجنسية الأولي من استنساخ الخلايا المكون من 45 خلية ، ويحدث التخصيص في بداية المعيدة. ثم يحدث فصل التكاثر ، وأثناء تكوين المعيدة ، تدخل الخلايا الجنسية الأولية الأديم المتوسط الخارج عن النطاق وتوجد في قاعدة البرعم الأنثوي ، خلف النطاق الأساسي. من هناك تهاجر الخلايا الجرثومية الأولية نحو النهاية البطنية للأديم الباطن لطبقة الوريد الباطن ثم تتحرك بنشاط من خلال المساريق ، وتزويع البكرات التناسلية في نهاية الهجرة. في عملية الهجرة ، وكذلك في أول 2-3 أيام من التوطين في بدائل الغدد التناسلية ، تتكاثر الخلايا الجنسية الأولية بشكل فعال وتخضع لثماني دورات متكررة. إذا كان هناك في بداية الهجرة حوالي 50 خلية جرثومية أولية ، في الخراجات التناسلية لأجنة الفأر لتطور مدته 12 يومًا ، يتجاوز عدد الخلايا الجنسية الأولية 25000 خلية.

التشابه الوظيفي للمجالس الاقتصادية والاجتماعية والخلايا الجرثومية البدائية يوضح الاندماج الكامل لهذه الأخيرة في استبدال الكيسة الكتلة الخلوية الداخلية والتنمية الكاملة لاحقة من الجنين والأنسجة التي تتكون فقط من نسل الخلايا الجرثومية البدائية. وفقا لخصائص أخرى كانت الفئران الخلايا الجرثومية الأولية بغتش أيضا متطابقة، والتي تبين القدرة على التمايز إلى اتجاهات مختلفة، لتشكيل هيئات مضغي في المختبر، وهو في الجسم الحي شكل مسخي المبيض عند حقنه تحت الجلد في الفئران العوز المناعي تشبه مسخي المبيض عفوية الفئران الخصية خط 129 / ثالثا.

ومن الثابت أنه عندما تضاف إلى LIF المتوسطة، وmembrannosvyazannogo قابل للذوبان SIF عزل الخلايا الجرثومية الأولية من 8 أيام أجنة الفئران البقاء على قيد الحياة وتتكاثر في الثقافة لمدة 4 أيام ولكن بعد ذلك تموت. وعلاوة على ذلك، فإن فترة عندما لاحظت ثقافة الموت الخلايا الجرثومية البدائية تتزامن مع مرحلة تطور أجنة الفئران (12،5-13،5 أيام)، عندما تدخل الغدد التناسلية الخلايا الجرثومية الإناث براعم الابتدائية الانقسام المنصف، الإنقسامية وفي الخلايا الجرثومية البدائية الذكور مسدودة الانقسام. ومع ذلك، إذا قمت بإضافة إلى البيئة لا نمو الوحيد عوامل LIF وSIF، ولكن أيضا من FGF2، تستمر الخلايا الجرثومية الأولية proliferirovat، وشكلت ثقافات فرعية يمكن مستعمرات الخلايا تتكاثر حتى بعد إزالة من البيئة من عوامل النمو (SIF وجمعية جيل المستقبل). يمكن استزراع هذه الخلايا لفترة طويلة على الركيزة الليفية الجنينية دون إضافة عامل النمو القابل للذوبان LIF. هذه هي خطوط الخلايا المستقرة المستمدة من الخلايا الجرثومية الأولية التي اقترح أن تسمى الخلايا الجنينية الجنينية. لا يمكن اعتبار هذا المصطلح ناجحة كما هو الحال عندما مثقف EG-خلايا لا يمكن الحصول على الخلايا الجرثومية الجنينية، قادرة على تنفيذ المراحل اللاحقة من مراحل تكوين البويضات أو الحيوانات المنوية. ويرجع ذلك إلى حقيقة هذا أن خطوط EG-الخلية، على الرغم من المشتقة من الخلايا الجرثومية البدائية، ولكن في ثقافة الحصول على خصائص الخلايا الجذعية المحفزة الجنينية تفقد قدرتها على ارتكاب خط germenativnye. بعبارة أخرى ، تفقد الخلايا الجنسية الأولية خصائص السلائف المشيمائية عند الزراعة وتتحول إلى خلايا متعددة القدرات تشبه ESC.

يشار إلى أنه عندما تدار الفئران EG العوز المناعي ، لا تنشأ teratomas. من المفترض أن فقدان قدرة الخلايا البائية البشرية على البدء بالتشوهات المرضية يرجع إلى حقيقة أن هذه الخطوط لم يتم إنشاؤها مباشرة من الخلايا الجرثومية الأولية المستزرعة ولكن تم الحصول عليها من الخلايا المعزولة من الأجسام الجنينية. لذلك ، من الممكن أن يكونوا من أحفاد الخلايا متعددة القدرات ، لكنهم ملتزمون بالفعل.

تجدر الإشارة إلى أن هناك اختلافات جوهرية بين الخلايا EG والخلايا الجرثومية الأولية. هذا الأخير لا يجعل من الممكن الحصول على أجنة الفئران الخيمرية ، مما يدل على عدم قدرة الخلايا الجرثومية الأولية على الاندماج في كتلة الخلية الداخلية أو تروفيكتيرم. إن خصائص السكان في الخلايا الجنسية الأولية تشبه إلى حد كبير الخطوط الملتزمة للخلايا الجسدية للأجنة المتأخرة ، ولا يؤدي إدخالها إلى الكيسة الأريمية إلى تكوين أجنة خيمرية.

تقنيات التغيير في زراعة الهيئات مضغي تم الحصول عليها مع EG-تجميع الخلايا التي يسمح بها الاختيار على وسائل الاعلام انتقائية لاستقبال السكان أخرى من الخلايا المحفزة، ودعا "الخلايا المشتقة من الهيئات مضغي (الجسم مضغي المستمدة الخلايا - EBD خلايا). قدرة خلايا EBD على التكاثر لفترة طويلة في الثقافة سمح لها بإنشاء خطوط خلايا ثابتة من الخلايا الملتزمة. تم الحصول على نسخ من الخلايا التي تعبر عن طيف واسع من mRNA وعلامات البروتين للخلايا المتخصصة. هذا النهج نتيجة لذلك ثبت أن الجنس الأساسي الخلايا المحفزة الإنسان، والتفريق في المختبر إلى مختلف أنواع الخلايا: الخلايا العصبية، الدبقية، بطانة الأوعية الدموية، والخلايا المكونة للدم والعضلات، وخلايا الأديم الباطن.

مصادر بديلة للخلايا الجذعية الجنينية

يمكن أن يكون المصدر البديل لخطوط ESC البشرية خلايا هجينة. زرع في رحم بنية الأبقار pseudopregnant geterogenomnoy الحصول عليها عند دمج عبر Electroporation للfetusa الخلايا الجسدية الإنسان مع الأبقار البيض، والتي أزيلت في وقت سابق من طليعة النواة، يجعل من الممكن الحصول على الكتلة الخلوية الداخلية من قبل زرع الأجنة مراحل النمو الاصطناعية. لهذا ، يتم الحصول على الكيسة الأريمية من بويضة البقرة مع النواة المزروعة للخلية البشرية في المرحلة الأولى.

في المرحلة الثانية ، يتم استخراج الأجنة من الكيسة الأريمية ، ومنه - ESC وفقًا لطريقة طومسون. من الجدير بالذكر أنه تم الحصول على أفضل النتائج على عزل الخطوط ESC باستخدام هذه الطريقة باستخدام نواة الخلايا الجرابية أو الخلايا الجرثومية الأولية التي تستمر في جسم الإنسان في حالة من السبات. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن البيض بقرة زرع الخلايا البشرية neukorochennye نواة ينبغي أن يكون النشاط العالي وtelomeazy التيلومير أن يتجنب استنساخ ESC الشيخوخة المبكرة المستمدة من البيض الهجين (ريبين، 2001) هذا. من المعروف أن أهم بروتينات EGF الموجودة داخل الخلايا هي Oct3، Oct4، Tcf، Groucho ، والتي تنتمي إلى ما يسمى بروتينات كاتومين كاتامين. كاتمات الصوت توفر تعبئة مدمجة خاصة من هيتروكروماتين ، مما يمنع تشكيل حلقات من اليوكروماتين. ترتبط حزمة الكروماتين التي تتوسطها هذه ال withروتينات بتناغم الجينوم ESC. حتى الآن ، ثبت أن البويضات الناضجة من الأبقار والبشر هي النوع الوحيد من الخلايا المتخصصة التي تحتوي على تركيزات عالية من بروتينات كاتم الصوت في السيتوبلازم. على هذا الأساس ، تم تطوير طريقة لإنتاج ESCs المهجنة عن طريق نقل نواة الخلية الجسدية إلى البويضات غير النووية للأبقار. وقد أظهرت الدراسات الأولية في المختبر أن السيتوبلازم لخلايا بويضة الأبقار يعيد توتيرة الجينوم البشري لنواة الخلية الجسدية في 12-24 ساعة من الزراعة.

من الأهمية بمكان وجود بيانات عن سمات تطور ما قبل الزرع للأجنة البشرية ، والتي تشير إلى استبدال لاحق للخلايا القفوية من خلال مجموعة من الخلايا متعددة القدرات من الفئران. وأظهرت دراسة التحولات الخلوية أن خلايا كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية البشرية ، بالإضافة إلى المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، تولد أيضاً خلايا أروماتوبلاستية ، مما يدل على قوتها الكلية.

ومن المعروف أنه في مرحلة الكيسة الأبرية هناك نوعان من التجمعات المختلطة بشكل مختلف. واحد منهم هو الطبقة الخارجية من الكيسة الأريمية ، trofectoderm ، المشتقة من خلايا الأرومة الغاذية والمكونات الجنينية الجنينية الأخرى. يتم تجميع مجموعة ثانية من الخلايا في كتلة كثيفة ، والتي تتصل السطح الداخلي لل trophectoderm. تستمد خلية السكان من كتلة الخلايا الداخلية من جميع الأنسجة والجراثيم من أجهزة الجنين. في مرحلة الكيسة الأريمية المتأخرة ، يتكون الأديم الباطن الجنيني الإضافي من كتلة الخلية الداخلية ويتكون الأديم الظاهر (الأديم الظاهر الأولي). في الوقت نفسه ، تحتفظ خلايا الأديم الظهاري بالقدرة على التعدد ، في حين أن القدرة على تمييز خلايا الأديم الباطن خارج جرثومي محدودة.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

حتى وقت قريب ، كان يعتقد أنه كان من المستحيل الحصول على ESC من الأرومة الغاذية. ومع ذلك مضاعفا الخلايا الجذعية خط الأديم الظاهر الغاذي معزولة عن الكيسة في المتوسط الذي يحتوي على، بدلا من LIF والهيبارين FGF2، يتكاثر وتحويلها إلى خلايا جذعية. إذا قمت بإزالة من وسط FGF2، وخلايا الأديم الظاهر الغاذي تتوقف تربية، فإنها تبدأ تنسخ داخلي من الصبغيات والعناصر الخلوية trofektodermalnye تحولت تدريجيا إلى خلايا الأرومة الغاذية العملاقة. ربما، LIF لا يحفز تكاثر الخلايا الأديم الظاهر الغاذي يرجع ذلك إلى حقيقة أن FGF2 يتسبب في transsignalizatsii آلية كما FGF2، ملزمة لمستقبلات هيولي (FGFR2)، وتفعيل كيناز MAP في السيتوبلازم - ERK1 وERK2. ونتيجة لذلك، عندما تدمج خلايا الكيسة من مسار الإشارات واحد (LIF - gpl30 - JAK-كيناز - STAT3) تتحول خلايا الكتلة الخلوية الداخلية في hESCs المحفزة، في حين تفعيل الآلية الثانية من إشارات عبر الغشاء (FGF2 - FGFR2 - MAP تحركات ERK1 / ERK2) في الكيسة الأريمية ، يتم تشكيل الخلايا الجذعية من تروفيكتيرم. يعتمد اختيار مسار الإشارة ، بدوره ، على نشاط الجينة oct4. يتم التعبير عن هذا الجين ينتمون نطاق POU، وتقع في موضع ر 17 الجسمية وخلال مراحل تكوين البويضات، في سحق الفترة وكذلك في خلايا الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة، وفي الخلايا الجرثومية البدائية. وظيفية الجينات دورا oct4 وترميز عامل النسخ اللازمة لحدوث خلايا متعددة القدرات، والتمايز، وفقد التمايز.

يختلف تعبير جين oct4 في ESC بناءً على تفاعل عامل النسخ هذا مع العوامل المساعدة. أظهر تنظيم اتجاهي لتعبير oct4 في الكيسة الأريمية أنه عندما ينقص نشاطه ، فإن نصف الخلايا تشكل تروفيكتيرم ، في حين أنه مع زيادة في التعبير الناجم عن oct4 ، يحدث في الغالب ESC.

في التجربة ، لا يمكن تحويل ESC إلى خط عند زراعة blastomeres totipotent في مرحلة من سحق ، وكذلك في مرحلة المعيدة والمراحل اللاحقة من التطور الجنيني. عادة ما يتم تخصيص ESC ESC في اليوم 3-5-4.5 من الحمل ، والذي يتوافق مع السادس (الكيسة الأريمية المفردة) والمرحلة السابعة (الكيسة الأريمية ثنائية الطبقات - أسطوانة بيضة مبكرة) من التطور الجنيني الطبيعي. من الواضح ، فقط في فترة ما قبل الزرع ، تحتوي أجنة الفئران على تجمعات خلوية يمكن تحويلها إلى ESC. وبالتالي ، فإن عزل خطوط ESC ممكن فقط في مراحل معينة من التطور الجنيني. Totitipotent ، من وجهة نظر إمكانية تطوير جنين قابلة للحياة مع الأغشية الجنينية والمشيمة ، هي zygote و blastomeres التي تنشأ أثناء التكسير. يبدأ فقدان القوة الكلية للخلايا الجرثومية في المرحلة الأخيرة من المراحل المتأخرة ، عندما يتوقف التشوه أكثر على موقعها. في وقت مبكر morate blaetomers تحتفظ tuipotency ، لأن التلاعبات التجريبية مع التغييرات في موقعها ، على سبيل المثال ، عكس موقعها ، لا تمنع تطور الجنين الكامل.

وقد تبين أن كفاءة إطلاق ESC في الخط تتأثر بحالة الكيسة الأرجوانية في وقت اكتشافها. إن استخدام الكيسة الأريمية بعد وضع نموذج لسعة سبعة أيام في القناة التناسلية للفئران المتناظرة ovariectomized في اليوم 3.5 من الحمل وتلقي البروجسترون يعزز توزيع أكثر نجاحًا لخطوط الخلايا الجذعية الجنينية. ومن المفترض أنه في ظل هذه الظروف يزيد عدد blastomeres تشكيل الكتلة الخلوية الداخلية. ومن الممكن أيضًا أن تمتد دورة الخلايا وأن تدخل معظم جرثوم الأفيون مرحلة G0.

وعلاوة على ذلك، وإنشاء خطوط HESC المحفزة مستقرة يعتمد على الأجنة الوراثي: تماما تميز بسهولة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران الكيسات الأريمية خط 129، بشكل ملحوظ أكثر صعوبة في الحصول عليها باستخدام الفئران CS7BL / 6 و من المستحيل تقريبا لعزل الخط من hESCs الكيسات الأريمية الفئران CBA / كا. من الواضح أن الأجنة المبكرة تمتلك بعض الخصائص الجينية التي تؤثر على تطور خط ESC متعدد الفعالية. ومع ذلك ، في زراعة الأديم الظاهر المعزول ، وكذلك مع اختيار انتقائي للخلايا متباينة ، لا تزال خطوط ESC من الأجنة في وقت مبكر من الفئران CBA / Ca معزولة.

هناك طريقة قياسية مثبتة للحصول على خطوط ESK من الكيسة الأريمية يتم تقديمها في الأدلة المخبرية على تقنية تجربة الأجنة المبكرة. يمكن أيضًا الحصول على خطوط ESK التجريبية عن طريق استزراع الأديم الظاهر المعزول (الأديم الظاهر الأولي) لأجنة الفئران التي تمتد إلى 4.5 أيام باستخدام تقنية مجهرية معقدة وتعديل ظروف الزراعة. يبرر تعقيد هذا الإجراء ، لأن وتيرة تشكيل خطوط ESC كانت أعلى بكثير من العمل مع كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية.

لعزل خطوط ESC ، يتم نقل كل نسخة إلى بئر متناهية الصغر ، ويزرع ما مجموعه 40-60 خلية ، يتم تفريقها مرة أخرى. التكرار متعددة من هذا الإجراء يسمح للحصول على خط ESK خلد مع خلايا normokariotipnyh معدل انتشار القصوى تعلق على البلاستيك، والتي من خلال الممرات 50-100 الاحتفاظ شمول الوسع والنشاط تيلوميراز عالية. في عملية دعم الخطوط ESC ، تلوث البيئة أو المصل مع endotoxins البكتيرية هو الأكثر خطورة - حتى تركيزات أثر الذيفان الداخلي في وسط الثقافة يسبب الموت الجماعي للخلايا الجرثومية غير الناضجة. مع التحكم الدقيق في النمو الخطي والتشتت في الوقت المناسب من المجالس الاقتصادية والاجتماعية في الثقافة قادرة على الانشطار متماثل، فيه كل الخلايا الوليدة لا تزال المحفزة وقادرة على إجراء عدد غير محدود من دورات الخلايا، والحفاظ على النمط النووي مضاعفا وقوة الإجمالية.

يمكن أن يتم اختيار مجموعة نظيفة من الخلايا الجذعية البشرية البشرية بعد ترنسفكأيشن في جينومها من جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي تحتوي على تشفير جيني لتركيب بروتين فلوري أخضر (GFP). يزيد التعبير GFP مع نمو ESC في الظروف التي تدعم انتشارها ، في حين مع بداية التمايز ، يتم تقليل مستوى التعبير من هذا الجين ، والذي يسمح باختيار خطوط الخلايا المستقلّة متعددة القدرات المستقرة على وسيط انتقائي. عندما يزرع مع اختيار GFP المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، وتواتر زيادة المستعمرات بشكل كبير ، لأنه في ظروف المحاصيل اختيار يتم القضاء على تأثير مضاد التكاثرية القوية للخلايا المتباينة.

ترجمة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في خط عن طريق طريقتهم من عزل الأجنة قبل الزرع (الخطوة 80-120 الخلايا)، التي لا تزال بعد في المختبر إجراء الإخصاب. لهذا ، فإن الأجنة "الزائدة" التي يتم الحصول عليها بشكلٍ اصطناعي يتم تفريقها ميكانيكياً في بيئة إبرة Delbecco. بعد وضع علامة على الخلايا مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة انتقائية مع تسمية الفلورسنت ، يتم عزل خلايا الأجنة. تشتت الأجنة إلى خلايا فردية باستخدام خليط من ديسبازاز كولاجيناز. وقد نمت تنفصل الخلايا في وسط خاص (80٪ Delbekko المتوسطة + 20٪ مصل العجل الجنين في ظل وجود 500 .mu.g / مل من IL-6، LIF وSCF) على أحادي الطبقة من الخلايا الليفية الجنينية المغذية 3 فقرات الأولى. في هذه الحالة ، يتم دعم بقاء وانتشار الخلايا الجذعية والسلفية بالتعرض إلى IL-6 و LIF و SCF. في بيئة كهذه ، تنمو المجاميع النباتية المعزولة بواسطة مستنسخات التعليق من الخلايا غير المرصوصة ، والتي يجب فصلها عن طريق pipetting متعددة لطيفة. تظهر الحيوانات المستنسخة الجديدة في الثقافة المعلقة في اليوم الخامس - السابع. يتم تحقيق الحد الأقصى لمعدل نمو ESC عن طريق الانفصال المتكرر للمستنسخات في مرحلة 10-15 خلية. بعد ذلك ، يتم نقل كل نسخة إلى مستنبت ميكرويول وتصل إلى إجمالي 40-50 خلية. يتكرر الإجراء عدة مرات في الممرات ، مما يزيد من حجم الثقافة إلى كثافة من 5 إلى 10 ملايين خلية لكل كوب 6 سنتيمتر. باستخدام هذا طومسون الركض تم عزلها 10 استنساخ المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان الخالدة والتي من خلال الممرات 100 الإبقاء على النشاط تيلوميراز عالية، والقدرة على الانتشار المكثف والصفات المظهرية الحد الأدنى من مجموع قوة، مع التمايز في أي من 350 خطوط الخلايا المتخصصة التي هي مستمدة خارجي، meso- - الأديم الباطن. التفريق بين ESC البشري بدأ (في تغيير المتوسطة، إضافة وإزالة LIF المصل) مع مرفق الخلية إلى الركيزة، مما يدل على تطور الهيكل الخلوي والتعبير عن مستقبلات الالتصاق. من المهم أنه مع انتشار غير مقيد من المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، تم الحفاظ على النمط النووي العادي.

تعتمد الطريقة الثانية لعزل خطوط ESC البشرية على استخدام الخلايا الجنسية الأولية. وقد أظهرت الدراسات التجريبية أن خطوط الخلايا الأوروبية يمكن الحصول عليها من اللوحات التناسلية لأجنة من الفئران عمرها 12.5 يومًا. ومع ذلك ، في هذه الحالات ، كان تواتر تشكيل خطوط الخلايا السلف أقل بكثير من التجارب في الأجنة السابقة. في نفس الوقت ، تكون خلايا الجنس الأولية من أجنة الفئران من أجنة الفئران في عمر الحمل البالغة 13.5 يوم غير قادرة عمومًا على التحول إلى خطوط.

تم الحصول على أول خطوط ثابتة من الخلايا EG لخلايا بشرية متعددة القدرات من الخلايا الأولية في الغدة معزولة عن براعم الأعضاء التناسلية للأجنة البالغة من العمر من 5 إلى 9 أسابيع. كان المثقف الخلايا المعزولة على ركيزة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس المعطل في المتوسط DMEM مع مصل الجنين، والتي أضافت إليها المركابتويثانول، forskolin، فضلا عن عوامل النمو البشري المؤتلف (جمعية جيل المستقبل وLIF). بعد 7-12 يوم ، ظهرت مستعمرات متعددة الخلايا في الثقافة ، وفقا للخصائص المورفولوجية والعلامات الجزيئية المقابلة لخلايا EG البشرية. بعد التجميع ، شكلت هذه الخلايا أجسامًا شبيهة بالنمو ، مع ظهور مزيد من التطوير ظهرت الخلايا المتخصصة ، مميزة لمشتقات الأوراق الجنينية الثلاثة. في جميع أنحاء 10-20 الممرات حافظت خطوط الخلايا EG على النمط النووي العادي ولم تفقد تعدد القدرات.

ويظهر أيضًا أن التأثير المشترك لعوامل LIF ، وعوامل الغشاء الصلب والقابل للذوبان ، وكذلك TGF-b ، يعدل برنامج تطوير الخلايا الأولية للجراثيم. وبدلاً من إيقاف الانقسامات الانقسامية والبدء في التفريق نحو تكوين الأجنة أو تكوين الحيوانات المنوية ، تستمر الخلايا الجنسية الأولية في التكاثر. بعد عدة دورات الإنقسامية إضافية تصبح مشابهة لخلايا الأديم الظاهر ، وتحولت خواص خواص السلائف الجرثومية ، وتحولت إلى خلايا EG الجذعية الجنينية متعددة القدرات.

وهكذا ، في عام 1998 ، تم عزل الخلايا الخلدية للخلايا الجنسية الأولية لأول مرة من البوادر الجنسية لنسيج تشريح جثة الجنين البشري. يظهر التطور الجنيني من الخلايا الجرثومية الأولية الإنسان في الكيس المحي في الأسبوع الثالث من التنمية، وعلى الأسابيع 4-5th، وهذه الخلايا تهاجر إلى منطقة الحديبة الجنسية، حيث أنها تشكل سكان gonocytes dormantnye الأولية. في الحالة الخاملة ، تبقى الخلايا الجنسية الأولية في مهدها حتى الولادة. تم استخراج خطوط الخلايا الجرثومية الأولية من الحديبة التناسلية الأجنة القديمة 5-9-أسابيع الجنين استرجاع النسيج المؤقت السابق الذي تعامل مع خليط من نوع كولاجيناز IV-V، هيالورونيداز والدناز لمحصول زيادة الخلية الكمي والنوعي. تحاط خلايا جرثومية أولية في أنسجة حديبة الأعضاء التناسلية الجنينية بخلايا سيرتولي (mesenchymal). الغرض الوظيفي للخلايا سيرتولي هو إنتاج عوامل مكافحة أفكارك (فاس يجند)، mitogens، والأدوية المثبطة للمناعة التي تحمي الخلايا الجذعية الجنسية من الهجوم المناعي في الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب المكروية السدوية في الحديبة التناسلية دورًا مهمًا في نضوج الأمشاج. تزرع الخلايا الجرثومية الأولية المعزولة في الثقافة فوق طبقة انسجة المغذي التي تتكون من الخلايا الليفية الجنينية للممرات الثلاثة الأولى. التركيب الأكثر فعالية من mitogens هو مجمع يتكون من LIF ، FGF و forskolin (منبّه لتكوين cAMP). انتشار الخلايا الجرثومية البدائية في المختبر تتطلب إضافة مصل الجنين، في وجود gonocytes الاستنساخ الأولية في استنساخ الثقافة يرافقه تكوين خلايا كروية، غير ملتصقة إلى الركيزة.

وجاء المعاهد الوطنية الأميركية للصحة على أساس تلخيص المعلومات الموجودة على طرق تخصيص خطوط ESC الإنسان من الكيسات الأريمية الاستنتاج الأولي أن تخصيص الناجح لESC هو الأكثر احتمالا عندما الكيسات الأريمية مع مثقف بشكل جيد الكتلة الخلوية الداخلية (الخلايا الجذعية: التقدم العلمي واتجاهات البحوث في المستقبل Nat. Inst، of Health USA). من وجهة النظر هذه، أفضل مصدر للالمجالس الاقتصادية والاجتماعية لخلق خطوط الكيسة الإنسان اليوم 5TH التنمية، منها تخصيص الكتلة الخلوية الداخلية يجب إزالة بعناية الأديم الظاهر الغاذي. يجب أن تزرع معزولة الكتلة الخلوية الداخلية التي تتكون في هذه المرحلة من 30-35 الخلايا على الركيزة والخلايا الليفية الجنينية في الفئران، الذي هو شرط حاسم لتشكيل مستعمرات في ثقافة hESCs.

تحليل السمات المظهرية للخلايا الجذعية الجنينية

من الأهمية بمكان هو التحليل المقارن بين الأنواع من السمات المظهرية لل ESC. وقد تبين أن المستعمرات ESC الإنسان - وهي مجموعات كثيفة من خلايا الظهارية بالارض، في حين أن الفئران العجل مضغي تتكون من تكتل فضفاضة من خلايا مدورة. في ESC الإنسان ، فإن مؤشر نسبة البلازما النووية أقل مما كانت عليه في ESK الماوس. تشكل الخلايا الجذعية الجنينية للقرود مستعمرات خلايا مسطحة أخرى ذات حواف غير متساوية. في المستنسخات المبكرة من الرئيسيات ESC ، يمكن رؤية الخلايا المفردة بسهولة. المتكاثرة hESCs جميع أنواع الحيوانات لا تعبر عن MHC من الدرجة الأولى والثانية. وفي الوقت نفسه، المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان تعطي ردا إيجابيا على الأجسام المضادة TERA 1-60 وGCTM-2، مما يدل على وجود على سطح الكيراتين / الكوندروتن البروتيوغليكان كبريتات، سمة من الجنينية (مسخي المبيض) الخلايا الجذعية -kartsinomnyh بهم. التعبير في hESCs جميع أنواع الجينات الحيوانات oct4 توحي أنه على الرغم من الاختلافات المظهرية في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان والفأر، على ما يبدو تفعيلها من خلال نفس المجموعة من الجينات المسؤولة عن الحفاظ على تعدد القدرات (بيرو، 2001). وبالإضافة إلى ذلك، وخطوط ESC المستمدة من الفئران الجنينية والخنازير والأرانب والقرود، والماشية، ولها خصائص شكلية مماثلة، مجموعة مماثلة من تحديد الجزيئي للعلامات والآلية الجزيئية متطابقة تقريبا لتنفيذ برنامج التطور الجنيني الذي يسمح لك لإلقاء نظرة جديدة على مسألة زرع الأعضاء .

وخلافا للمرحلة التطور الجنيني الطبيعي في الجسم الحي، لا يصاحب في المختبر انتشار hESCs من تشكيل طبقات جرثومي والعائدات لمنع Nohgenov خلفية مثلية، أي دون توالد. منذ الجينات تجزئة لا تعمل في ثقافة hESCs المستحيل لإعادة إنتاج مثل هذه الفترات مرحلة التطور الجنيني كما تجزئة التبويب الجسيدة النواة، وتشكيل الكيس المحي، السقاء الأعضاء والأنسجة الوقتي وغيرها. تم تجميد الثقافة ESC في بداية تشكيل 350 خطوط تقييد الخلايا المتخصصة. وهكذا، الخلايا الاولية التابعة استنساخ وبغتش المحلية مركزيا هي نموذج الجنين الوحيد خلال التنمية في المناطق التي تتشكل الأنسجة المختلفة في مرحلة واحدة تختلف عن الخلايا المتخصصة المشتقة منها، ومع ذلك، من السلائف المشتركة. على الرغم من أن الحد الأدنى من المستقبلات على سطح hESCs، فإنها تحتفظ القدرة على أداء عمليات التخلق البدائية محاكاة الجزء الأكبر من هيكل الجنين في وقت مبكر: hESCs الطين في الثقافة والمجاميع يشكل بنية تشبه الكيسة أو حتى في وقت لاحق الأجنة (اسطوانات البيض). وقد سميت هذه المجاميع المعلقة بشكل مناسب أجسامًا بسيطة ومعقدة.

عندما تمزج التمايز إلى خلايا مختلفة من الجسم مضغي أعرب في وقت واحد في وقت مبكر من الأديم الظاهر الجينات (oct3، جمعية جيل المستقبل-5، العقدي)، الأديم الباطن (غاتا-4)، الأديم المتوسط (براتشيوري)، الأديم المتوسط قلبية (PKH-2،5)، الأنبوب العصبي (msx3 ) و hematopoiesis (elkf). باستخدام تركيبات مختلفة من السيتوكينات وعوامل النمو لاستهداف تكوين خلايا الطبقة الجرثومية في المختبر في عدد من الحالات كان من الممكن الحصول على الهيئات مضغي، التي أعرب عنها ويفضل الجينات الأديم الظاهر أو الأديم المتوسط، والذي يفتح الطريق إلى نمذجة تكون المعيدة والمرحلة توالد مبكرة.

نمو نسيلي من hESCs دليل على انقسام الخلايا غير المتماثلة في واحد فقط من ESC في استنساخ مركز تحتفظ غير يحد من القدرات الاستنساخ، في حين أن الخلايا ابنة أخرى يثير جيل من الخلايا الاصلية، والتمايز يأتي بالفعل في. ولذلك ، فإن معدل الضرب من استنساخ في محيط الجسم الجنيني أعلى من المركز. وتخضع الخلايا الهامشية في الاستنساخ المتنامي إلى تمايز اضطراب عفوي أو هجرة أو موت من خلال آليات الاستموات. هذه الأحداث هي التي تحدد مصير استنساخ إذا تجاوز معدل انتشار معدل الهجرة وموت الخلايا أفكارك، استنساخ متابعة أحجام لزيادة يحدث الاستقرار على قدم المساواة مع موت الخلايا المبرمج ومعدل تكوين سرعة خلية جديدة، الانحدار - نسبة العكسية لهذه العمليات. تنقسم الخلايا السلفية بشكل متناظر ، أي أن كلتا الخليعتين تتفرقان إلى خطوط خلوية متخصصة. تختلف نسبة الخلايا ESC / السلف ، ولكن دائمًا يكون مقدار ESC جزءًا فقط من نسبة مئوية من مجموعة الخلايا السلف. لذلك ، يمكن فقط pipetting دقيق وتصنيف الحيوانات المستنسخة في الوقت المناسب زيادة عدد المجالس الاقتصادية والاجتماعية في الثقافة. للحصول على أقصى قدر من العائد من ESC ، كان الأكثر فعالية هو تصنيف الحيوانات المستنسخة في مرحلة 10-12 خلية. يعتمد اتجاه ودرجة التفريق بين الخلايا في الجسم الجنيني على موقعها. خلايا الجسم مضغي الخارجية لا تعبر عن الجين وoct4 الخضوع التمايز في الخلايا الأديم الباطن الأولية التي شكلت لاحقا خلايا شبيهة بالظهارية والجداري خارج الجنين الأديم الباطن الحشوية. الخلايا الداخلية للجسم الجنيني تعبر عن الجين oct4 وتحتفظ بتعدد القدرات لمدة 48 ساعة من الثقافة. ولكن بعد ذلك يحدث إعادة تنظيم الصرفي في الثقافة أحادي الطبقة الظهارية تبدأ والتعبير عن الجينات التي تتحكم في تطوير الأديم الظاهر الأساسي. وعلاوة على ذلك، فإن عملية مجموع تمايز خلوي المختلين تبدأ مع ظهور أنواع مختلفة من الخلايا التي هي مشتقات من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. في عملية التمايز عفوية من خلايا الجسم مضغي أولا تنشأ المجاميع علامات الأديم الباطن في شكل شظايا (الخراجات) الكيس المحي. وعلاوة على ذلك ، تظهر الخلايا الأرانب والخلايا البطانية من الشعيرات الدموية المتنامية في هذه البنى. في المراحل النهائية من التمايز عفوية من الخلايا الداخلية للجسم مضغي تطور مختلف خلايا متباينة عضال، بما في ذلك الخلايا العصبية، والعناصر الدبقية، العضلية، الضامة، وخلايا الدم الحمراء. في تقريب معين (النظر في انقلاب المكاني للأوراق تشكيل الأنسجة الجنينية) عن طريق الهيئات مضغي في المختبر يمكن استكشاف عمليات التخلق وتحليل الآليات الجزيئية للتمايز خلوي الجنينية الفترة الأولية، وإنشاء دور للجينات محددة في تنفيذ هذه العمليات.

وهكذا ، داخل الاستنساخ هي الخلايا التي يتم فيها اكتشاف مختلف برامج التنمية الجينية - المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، الأسلاف الأوائل والتمييز بين المجموعات السلفية. زراعة ESC بواسطة أساليب انخفاض قطرة أو ثقافة كتلة بدون طبقة مغذية وبدون إضافة LIF في الوسط تؤدي حتمًا إلى تكوين أجسام جنينية. إن مورفولوجية الخلايا الخارجية والداخلية للأجسام الجنينية مختلفة. تتكون الطبقة الخارجية من خلايا عملية كبيرة. سطحها ، الذي يواجه البيئة ، مغطى بالعديد من الزغيبات الصغيرة. يتم فصل الطبقة الخارجية للخلايا من الغشاء القاعدي الداخلي الذي يشبه غشاء ريشيرت ، في حين أن خلايا الطبقة الداخلية للجثث الجنينية هي ظهارة أسطوانية. من الناحية المورفولوجية ، فإن الطبقة الداخلية ، على الرغم من احتوائها على العديد من الخلايا الفاصلة ، تذكرنا أكثر بمستعمرات ESC غير المتميزة.

ملامح الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

غياب التفاعلات متني الوسيطة في إشارة خلفية منع الجينات تكوين مثلي يسبب نمو المختلين من بغتش في الثقافة، لأن هذا التبويب مكسورة والأجهزة الوقتي البنية التحتية تشكيل. النمو غير المنظم والتمايز عفوية غير المنضبط من hESCs في الثقافة نظرا لعدم وجود الوسيطة بمناسبة إطار انسجة الهيئات في المستقبل: في المختبر من الممكن تشكيل الملايين من خلايا الكبد، ولكن لا يمكنك الحصول على أي شرائح الكبد، بما في ذلك العناصر الهيكلية والوظيفية، مثل الجيوب الأنفية، ومساحة الخلايا ديس وكوبفر.

ويعتقد أن تعدد القدرات من المجالس الاقتصادية والاجتماعية أدركت حصرا في مرحلة التطور الجنيني لتشكيل أنسجة وأعضاء الجنين، في حين أن الحبل السري والمشيمة وتستمد الأرومة الغاذية. المغلقة في قذيفة trofektodermalnuyu ESK تولد باستمرار استنساخ الخلايا الوقتي يدرك برنامج التنمية مرنا اندماجي السائبة Nohteyaov مصفوفة الطبوغرافية، التي تحدد مسبقا الترتيب المكاني والشكل والأبعاد، وعدد من خلايا الجهاز مؤقتة ونهائية والتجمع حمة في وحدة الهيكلية والوظيفية. وفي الوقت نفسه ESC هي نوع من الخلايا الوحيد الذي الآلية الجزيئية من تحقيق إمكاناتها فصلها تماما عن البرنامج الوراثي للتنمية وشركات خدمات الطاقة نفسها محرومة من إمكانية التفاعل مع الخلايا الأخرى بسبب انسداد كل التصورات مستقبلات وأنظمة transsignalizatsii. ومع ذلك، كافية المجالس الاقتصادية والاجتماعية تفعيل النتائج في تدريجي نشر التخلق إنهاء برنامج الولادة يتم تشكيل تماما وجاهزة للحياة خارج الرحم لكائن حي يتكون من بلايين الخلايا. في هذا الوقت القصير، ولكن الدين لا يمكن تصورها في مسار الفضاء لا مناص منه الخلوي للأخطاء في الآليات الجزيئية التي توفر الوظائف الحيوية للخلايا، وفي البرامج التي تتحكم بها انتشار، والتمايز والتخصص. لذلك، في علم الصيدلة الحديثة بصورة منفصلة مرض الأجهزة الجزيئية، وبرمجة خلايا المرض. وعمل لغالبية الأدوية الجديدة التي تهدف إلى تصحيح اسم البرنامج من التمايز، وانتشار وتوالد، فضلا عن تجديد الأعضاء والأنسجة البشرية. في الكائن الحي الكبار عبر المجالس الاقتصادية والاجتماعية يصبح من الممكن السيطرة على سلوك الخلايا الجذعية / السلف زرعها في الدماغ والكبد والطحال ونخاع العظام وغيرها من الإنسان أجهزة لإصلاح تلف المتلقي أجهزة متني بسبب التمايز والتخصص خلايا اللحمة المتوسطة المانحة الحفاظ على المصفوفة. أساسا، برنامج شمول الوسع تطلق آخر بويضة الجينوم مستوى، بيضات ملقحة وعن Blastomeres، ولكن هذه الخلايا ليس من الممكن بعد استنساخ وpassaged في الكميات اللازمة لتلبية احتياجات الطب experiental والعملي. ولذلك، فإن ESC هو مصدرا فريدا للمعلومات الوراثية التي تحتوي على خريطة ثلاثية الأبعاد الخطية تقييد الجنين ورموز من خطوط الخلايا المتخصصة خلال المعيدة.

تقريبا إمكانيات لا حدود لها من التجدد ESC يرجع ذلك إلى حقيقة أن الجينوم، وعلى النقيض من الجهاز الوراثي للخلايا جسدية متباينة، ويحافظ على تعدد القدرات. أحد مظاهر حالة سبات متجذرة في المعلومات الوراثية المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو ما يسمى الحد الأدنى النمط الظاهري - على سطح ESC للتعبير عن عدد محدود من المستقبلات، وبالتالي نشر عدد قليل جدا من برامج للتفاعل جهاز النووي transsignalizatsii الخلية مع المكروية لها. على خلفية الجينات السبات المسؤولة عن فرض قيود على خطوط الخلايا المتخصصة وتمايز الخلايا، تنشيط فقط حوالي 30 من 500 الجينات التي توفر الخلايا التواصل مع المكروية المحيطة المنتجات. باستخدام طريقة التحليل التسلسلي في التعبير الجيني أظهرت أن عمومية الرئيسية صناديق الجينوم وظيفية تنظيم الطاقة والأيض في الخلايا الجسدية والمجالس الاقتصادية والاجتماعية في الماضي تحدد كمية قليلة للغاية من مرنا من المستقبلات، G-البروتينات، رسل الثانية، transcriptases، العوامل المساعدة التعبير والقمع وهذا هو، إشارة التنظيمية النظام بأكمله عبر الغشاء إلى داخل الخلية. هذا يرجع إلى نقص أو تعبير منخفض جدا من الجينات transsanalization. خلال تمايز يتسبب في جينوم ESC 18 عملية وتوقف عملها بشكل متزامن جينات خلفية تفعيل transsignalizatsii 61 الجين السيطرة على تخليق مستقبلات الخلايا الالتصاق، مكونات المصفوفة خارج الخلية، وتقييد transcriptases عناصر messendzhernyh ونظام نقل الإشارات لوحدة النووية مع البلازما مستقبلات غشاء الخلية. منعت في وقت واحد التعبير عن الجينات المسؤولة عن تصنيع البروتينات كواتم الصوت، فضلا عن التعبير الجيني koingibitorov توفير hESCs شمول الوسع الجينوم.

تم العثور على علامات الجينية لخلايا جميع الأوراق الجنينية الثلاثة. تحديد طبقة الخلايا الأدمة التي تقوم على التعبير عن الجينات العقدي، oct3 وجمعية جيل المستقبل-5، وخلايا أرومية متوسطة - براتشيوري الجينات، زيتا-الغلوبين، الأديم الباطن - في التعبير الجيني غاتا-4. في مرحلة التطور الجنيني الطبيعي، أثناء تكون المعيدة يلاحظ وجود هجرة نشطة من السكان غير ناضجة من الخلايا الجذعية والسلف، تعيين محليا مناطق عظام الوجه الجمجمة، وبعض أجزاء من الدماغ والجهاز العصبي المحيطي، ونظام التوصيل القلبي والأنسجة الصعترية التي تتشكل من الحيوانات المستنسخة نزوح الخلايا. خلية وصفها الجينات في وقت مبكر طبقات جرثومية يجعل من الاسهل لتحليل الطوبوغرافية للهجرة الخلايا الاصلية في الجنين النامي. انها وجدت على وجه الخصوص أن الخلايا في المجاميع embryocarcinoma التعبير P19 من أول براتشيوري الأديم المتوسط الجين يبدأ خلال خفض التعبير الجيني من منشط البلازمينوجين الأنسجة، على بعد فيتوبروتين، الكيراتين 8، والكيراتين 19، والتي هي علامات من الأديم المتوسط أوائل السكان المهاجرة. وبالتالي، فإن تكوين الأنسجة الأصلية أرومية متوسطة يبدأ إلا بعد عملية الهجرة ونقطة تصفية خلايا أرومية متوسطة السلف.

مع ميزات المظهرية محدودة للغاية، وغياب اغلب الكتل transsignalizatsii ESC مع ذلك تعبير عن بعض جزيئات المستقبلات التي يمكن استخدامها لتحديد وضعهم. ومن الجدير بالذكر أن المستضدات هي كانت علامات ESC في البشر والرئيسيات المشتركة. غالبا ما تستخدم لوضع العلامات hESCs المسمى الأجسام المضادة لمستضدات membrannosvyazannym SSEA-3، SSEA-4 (المستضدات الدهون فريدة تمثل GL7 شحمي سكري معقد مع الحامض اللعابي)، فضلا عن بروتينات سكرية عالية البوليمر TRA-1-81، TRA-1-60. وعلاوة على ذلك، hESCs تعبر محددة المستضد الجنيني SSEA-1 والفوسفاتيز القلوية الذاتية، فضلا عن عامل النسخ محددة Oct4. مطلوب الأخير للحفاظ على آليات انتشار hESCs - عامل النسخ محددة Oct4 الجين ينشط التعبير عن نمو الخلايا الليفية التعبير الجيني عامل 4 و استقرار الملاكمة مسؤولة عن غير مما يحد من مضاعفة DNA في الخلايا غير الناضجة. البروتينات أهم علامة داخل الخلايا هي Oct3، Oct4، تريليون قدم مكعب وغروشو، تتعلق البروتينات من الكروماتين كواتم الصوت.

على الفور تقريبا بعد على المدى الطويل محاولات المجالس الاقتصادية والاجتماعية الثقافية وغير ناجحة والكائن الثقافة من الخلايا الجذعية المعزولة من الكيسات الأريمية الماوس، وزراعة الخلايا الجرثومية الأولية التي أعدت لأول مرة، بدأت الدراسات قدرة ESC تعدد القدرات مرحلة عندما تدار في المراحل الأولى من تطور الجنين. وقد تبين أنه في تويتة وبغتش الكيسة قادرون على تشكيل أجنة خيالية الذي أحفاد بغتش المانحة رصدت في جميع الأنسجة الجسمية وحتى في الأمشاج. وهكذا، في علم الأحياء التنموي باستخدام ESC البرمجة "جسر" بين الدراسات التجريبية في الجسم الحي في المختبر، والتي زادت بشكل كبير من إمكانية دراسة عمليات إرسال الأنسجة الابتدائية وأجهزة، والتمايز، وتوالد الجنينية.

ومن الواضح أنه ثبت في الجسم الحي في عملية التطور الجنيني ، يتم دمج ESC في كتلة الخلايا الجرثومية في وقت مبكر ، ويتم العثور على مشتقاتها في جميع الأجهزة والأنسجة. تستعمر الخلايا الجذعية الجنينية في الجنين الخيميري خطًا من الخلايا الجنسية ، التي ينحدر منها البويضات الكاملة والحيوانات المنوية. الخلايا الجذعية الجنينية هي مولد الرمع - يمكن بغتش واحدة خلق متطابقة وراثيا إلى مستعمرة من الخلايا مع الواسمات الجزيئية، والتي تشمل التعبير oct4 الجينات والفوسفاتيز القلوية، والنشاط تيلوميراز عالية، وكذلك التعبير عن مستضدات جنينية محددة.

لدراسة آليات التطور الجنيني باستخدام تقنية hESCs chimerization تويتة عن طريق إنشاء هيكل البيولوجي، الذي يقع خارج طبقة عن Blastomeres رباعي الصيغة الصبغية المستفيدة والجهات المانحة بغتش تدار فيها. وهكذا، شكلت الأرومة الغاذية من أحفاد عن Blastomeres رباعي الصيغة الصبغية المتلقي الذي يمكن غرس والمشيمة، وبغتش المانحة بوصفها الكتلة الخلوية الداخلية، الذي يتكون من خط الجرثومية قابلة للحياة من الجسم والسلف الأمشاج الأولية. قيمة دراسة ESC لا تكمن فقط في أنه عندما التلاعب في المختبر مع الجينوم على الاحتفاظ تعدد القدرات، ولكن أيضا في حقيقة أنه في حين أن الحفاظ على القدرة على المشاركة في تشكيل hESCs الخلايا الجرثومية البدائية الجنين خيالية. وتبين أن نسل واحد فقط من بغتش المعدلة وراثيا استعمار جميع الجراثيم الأولية وتشكيل نسيج الجنين خيالية حصلت عليها التجميع أو coculture من الخلايا مع الجنين 8 خلايا. عندما زرعها في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران تويتة transfected مع الأخضر الجين ببروتين، تم العثور على أحفاد الفلورسنت من الخلايا في جميع أنسجة التحقيق الجنين النامي (شيمادا، 1999). زرع ESC في تويتة يمكن أن تخلق الفئران قابلة للحياة، وهي الهيئة التي يتكون فقط من نسل تبرعت ESC، والذي يفتح آفاقا لمجموعة متنوعة من خيارات الاستنساخ العلاجي. الآن وقد تم تطبيق هذا النهج المنهجي بنجاح لدراسة مشاكل البيولوجيا التطورية، على وجه الخصوص، فإنه يمكن تحليل آليات وراثية من تعطيل للكروموسوم X أو عدم الاستقرار جينية من hESCs. كما يستخدم زرع ESC في الجنين المبكر في التكنولوجيا الحيوية في الزراعة ، وكذلك في تجارب العلاج الجيني.

يتم استخدام عمليات زرع المجالس الاقتصادية المعدلة وراثيا لاختبار الخلايا المستهدفة من الجينات الطافرة. في المجال الثقافي المعتمد مثقف تستخدم في التكنولوجيا الحيوية لإنشاء الفئران بالضربة القاضية. لهذا الغرض، من خلال إعادة التركيب مثلي لشطبها من الجينات المجالس الاقتصادية والاجتماعية دراسة (خروج المغلوب) وسائل الإعلام انتقائية تفرز الخلايا التي تفتقر إلى هذا الجين. ثم يتم حقن المجالس الاقتصادية والاجتماعية في الكيسة الأريمية أو تجميعها مع blastomeres من morula. يتم زرع الأجنة المبكرة خيالية مما حصلت عليه إلى أنثى المستفيدة والفئران حديثي الولادة اختيار بين الأفراد مع الأمشاج، nullizigotnymi من هذا الجين. مع هذه التكنولوجيا ، تم إنشاء العديد من خطوط الفئران بالضربة القاضية ، والتي تستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا التجريبية والطب التجريبي. على هذه النماذج البيولوجية ، يتم دراسة أهمية بعض الجينات في التطور الجنيني ، وكذلك دورها في آليات الأمراض والظروف المرضية للإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام خطوط الحيوانات القاضية في مرحلة الاختبار قبل السريرية للطرق الجديدة للعلاج الجيني. على سبيل المثال، وذلك باستخدام ترنسفكأيشن الجينات في ESK أليل الطبيعي للجينات متحولة إدارة تصحيح فعال الطفرة، يضرب نظام مكون الدم. إدخال الجينات الغريبة في ESC يسمح بإنشاء خطوط من حيوانات المختبر المعدلة وراثيا متماثل بنسبة متسرعة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية موجهة إعادة التركيب الجيني الحذف عمل موثوق بها حتى الآن سوى نسبيا الفئران ESC. عن طريق المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران خروج المغلوب مزدوج تثبيت الوظيفية العنقودية دور مجال الجينات على الكروموسوم 7 (نسخة المنطقة الجينومية كروموسوم 19 دقيقة البشري)، والجزء القريب من كروموسوم ال11 (نسخ كروموسوم 5d للالبشري) - حذف هذه الجينات في سمحت الفئران ESK لتقييم وظيفة نظائرها في البشر.

الدراسات وظيفة قدرة الجينات الجنينية البشرية، ترنسفكأيشن في الجينات التي سمحت حيوانات المختبر hESCs في التشفير معين توضح دور الجينات في علامة التبويب والتي تشكل الجينات الأديم المتوسط قلبية، باكس 6 - في مرحلة التطور الجنيني العين. يشكل أول تعبير الجينات في غير ناضجة بطاقة المتكاثرة ESC سرطانة مسخية وأكد الفئران الكيسة القمع الساحق في الجينات transsignalizatsii ESK. الجمع بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية متحولة 60-80 و20-30 خلايا أجنة الفئران قبل الزرع العادية يؤدي إلى تطوير أجنة خيالية فيها المواقع المفضلة تتكون من خلايا المانحة والمتلقية الهيئات، التي تسمح لنا لتحديد دور الجينات المجهولة في المعيدة وتوالد. خريطة وظيفية من الجينات تطوير أجنة الفئران تفاصيل موسعة عن دور الجينات سادس-1 التبويب في الغدة الكظرية وبراعم الأعضاء التناسلية، WT-1 الجينات - في الكلى الجينات الأسرة التبويب myoD - في علامة التبويب الأسرة الجينات العضلات والهيكل العظمي غاتا-1-4 - في نضوج تقييد أساسيات erythro- و lymphopoiesis.

توجه الخروج من الأليلات الأم والأب من الجينات في hESCs باستخدام ناقل recombinase عمل لتوضيح وظائف الجينات المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني والتكنولوجيا في وقت مبكر تستهدف الجينات المجهولة الإنسان في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس يساهم في اكتشاف جينات متحولة جديدة المسؤولة عن تطور أمراض وراثية خطيرة. باستخدام طريقة خروج المغلوب يعرف أهمية تلزم بعض الجينات لزرع الأنسجة الجنينية: غاتا-4 - لاحتشاء، غاتا-1 - لمحمر مكون الدم الأنسجة، myoD - العضلات والهيكل العظمي، براتشيوري - لتقييد الأديم المتوسط transcriptases hnf3 وhnf4 - ل الخلايا الجذعية الكبد، خرقة-2 - المواقع المفضلة لاستنساخ T والخلايا الليمفاوية B (ريبين، 2001). وقد فتحت الحذف مزدوجة من الجينات في hESCs الوصول إلى دراسة الدور الوظيفي للجينات طبقات جرثومي، وتجزئة وتكوين مثلي وزرع ESC نظرا لإمكانية الحصول على أجنة مهجنة بين الأنواع قابلة للحياة. مع تحسين أساليب زرع بغتش المانحة في واحد الجنين 8 خلايا ثبت أن chimerization على المستوى الخلوي للعديد من أجهزة الجنين المتلقي. لاحظ أنه تم العثور على براعم الخلايا في الأنسجة أجهزة الفئران المتلقي الإنسان بعد تناوله من الخلايا الجذعية المكونة للدم الإنسان في الكيسة. وقد وجد أن في أجنة الفئران خلال تشكيل هيئات الدموية hESCs المحفزة. فمن الممكن أن الوظيفة البيولوجية التي هي تنظيم الجهاز المناعي للجنين في المستقبل. مع ESC في المختبر مستنسخة نماذج كافية من مرض وراثي البشري: ضعف نماذج خروج المغلوب الدستروفين الجينات في الفئران من ضمور العضلات دوشين، واغلاق أجهزة الصراف الآلي الجين (مراقبة إشارة التوليف كيناز لونين) - ترنح-teleangektaziyu. في هذه الحالة، وهو مرض وراثي مميت عند الأطفال بسبب عيوب في إصلاح الحمض النووي يتطور تنكس الخلايا العصبية في المخيخ، والذي يرافقه ارتداد من الغدة الصعترية بسبب وفاة الخلايا المتكاثرة. العيادة، الفيزيولوجيا المرضية وpatomorfologija tazii-ترنح teleangek- مستنسخة عن طريق إدخالها في ESC المعلومات الجينية الشاذة من الوهم الفئران مماثلة لتلك في البشر. وعلاوة على ذلك ترنح-teleangektazii باستخدام بغتش والفئران بالضربة القاضية بتطوير نموذج تجريبي، وبعض وراثية الأمراض التي تصيب الإنسان متماثل المرتبطة بالاضطرابات من الكربوهيدرات والتمثيل الغذائي للدهون، هدم الأحماض الأمينية، وإزالة النحاس والبيليروبين، والتي زادت بشكل كبير من إمكانية الطب التجريبي لاختبار قبل السريرية وسائل جديدة لعلاج الأمراض ذات الصلة شخص.

[12], [13], [14], [15]

استخدام الخلايا الجذعية cytohybrid

الخلايا الهجينة التي تم الحصول عليها عن طريق دمج الخلايا الجسدية من hESCs، هي نموذج ملائم واعدة لدراسة الخلايا الجذعية تعدد القدرات وإعادة برمجة الخلايا الكروموسومات متباينة. حصلت Tsitogibridy من اندماج ESC مع خلايا متباينة من حيوان بالغ، وتوفير فرصة لدراسة العلاقة بين جينومات "الأعمار" مختلفة: تطور حالة فريدة من نوعها حيث الكروموسومات المتجانسة مستمدة من خلايا مراحل مختلفة من التمايز، ودرجة من النضج متفاوتة، في نفس النواة، حيث يمكن بسهولة مشاركة transdeystvuyuschimi إشارات التنظيمية. ومن الصعب التنبؤ كيف سيكون رد فعل tsisregulyatornye نظام جينية من الكروموسومات المتجانسة القائمة خلال YN تطوير dividual، وذلك استجابة لإشارات تأثير transdeystvuyuschih من الجينوم الجنينية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، في الخلايا الهجينة يحدث فصل كروموسوم الوالدين الذي يسمح لدراسة التفاعل بين العوامل الوراثية على مستوى الكروموسوم منفصلة، أي، من المحتمل تحديد جزء من الكروموسومات المحددة في الحفاظ على تعدد القدرات، أو على العكس ، وهو ناتج في التمايز.

وبما أن النموذج التجريبي الأول لدراسة التفاعل بين العوامل الوراثية من "تاريخ التطور" مختلفة تستخدم tsitogibridy التي تم الحصول عليها عن طريق دمج teratokartsinomnyh المحفزة والخلايا الجسدية متباينة. في بعض الحالات ، تحتفظ الخلايا الهجينة هذه بخواص متعددة القدرات على مستوى عالٍ بما فيه الكفاية. على وجه الخصوص، وقد يتسبب في الجسم الحي الهجين الجسدية teratokartsinomno خلايا تطوير مسخي المبيض الحقيقية التي تحتوي على مشتقات من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث، في المختبر في الثقافات تعليق شكلت الهيئات مضغي. حتى في هذا النوع من بين الأنواع tsitogibridov لاحظت وجود مستضدات الجنين في الحالات التي كانت الشريك الجسدية في الاندماج مع الخلايا الليمفاوية سرطانة مسخية أو thymocytes. من الجدير بالذكر أن هجينة cyto-hybrids التي تم إنشاؤها بواسطة انصهار خلايا teratocarcinoma مع الأرومات الليفية تقابل الأرومات الليفية وفقا للنمط الظاهري.

والأكثر أهمية هو أن الحقائق الثابتة أن الخلايا الهجينة جسدية ظهرت teratokartsinomno في وعلامات إعادة برمجة الجينات من الخلايا المتمايزة، يتميز تنشيط الجينات الفردية أو غير نشط X كروموسوم الشريك الجسدية. وهكذا، فإن نتائج البحوث على الخلايا الجسدية teratokartsinomno نوع tsitogibridah تشير إلى أن الخلايا الهجينة في كثير من الأحيان الاحتفاظ تعدد القدرات وإعادة برمجة من الجينوم، وهناك دلائل على شريك الجسدية.

في التجارب للحصول على خلايا الهجينة ضمن النوع الجنينية عن طريق دمج splenocytes مع الحيوان المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس الكبار درس الخصائص مثل tsitogibridov، تحليل فصل الكروموسومات الأبوية وتقييمها الجينوم تعدد القدرات الهجين. للحصول على الخلايا المختلطة بين الأنواع التي تنتجها الخلايا سرطانة مسخية الاندماج مع الخلايا الجسدية، وتتميز عموما العزل منخفض من الكروموسومات مع النمط النووي رباعي الصيغة الصبغية أو شبه رباعي الصيغة الصبغية. لوحظ وجود تكوين كروموسومي مماثل في cytohybrid بواسطة اندماج الخلايا الجنسية الأولية مع الخلايا الليمفاوية. وفي الوقت نفسه، فإن الخلايا المختلطة بين الأنواع التي تم الحصول عليها نتيجة لاندماج المنك الماوس الخلايا اللمفاوية خلية teratokartsinomnyh، كان هناك فصل شديد من الكروموسومات الجسدية شريك.

وجاءت مرحلة جديدة نوعيا في دراسة فصل الكروموسومات الأبوية الهجينة بين الأنواع بعد تطوير طريقة تحليل الصغرية باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل، حيث وجد كل كروموسوم الماوس بضع مئات من علامات، مما يسمح للتميز بشكل موثوق بين أي زوج من الكروموسومات المتجانسة في الخلايا الهجينة.

عن طريق دمج ESK (باستخدام HM-1 خلايا نقص في النشاط gipoksantinfosforiboziltransferazy، 2N = 40، XY، معزولة عن الكيسات الأريمية الماوس السلالة 129 / 01A) مع splenocytes من الفئران خط مسانج DD / ج فشلت في الحصول على مجموعة من الحيوانات المستنسخة الهجينة زيارتها شكليا تشابه إلى hESCs. تم عزل جميع الحيوانات المستنسخة في المتوسط انتقائية، حيث النمو لا يمكن تحقيقه إلا مع gipoksantinfosforiboziltransferazoy خلية نشطة. وكشف التحليل الكهربي وجود جميع الحيوانات المستنسخة أليلية البديل gipoksantinfosforiboziltransferazy مميزة الفئران DD / ج. باستخدام التحليل الوراثي الخلوي، تبين أن أربعة لديها ثلاثة استنساخ الهجين okolodiploidny مجموعة من الكروموسومات. واحد شبه رباعي الصيغة الصبغية استنساخ يتضمن اثنين من السكان الخلايا الهجينة، واحدة منها كانت رباعي الصيغة الصبغية، والثاني، أصغر - مضاعفا.

تحليل الصغرية السماح للتمييز أي زوج من الكروموسومات المتجانسة الماوس 129 / 01A وDD / ج، في استنساخ هجين مع مجموعة okolodiploidnym أظهرت أن الحيوانات المستنسخة وقعت في اثنين متميزة القضاء تفضيلية الشريك الجسدية الجسمية. كان معظم الحيوانات المستنسخة جسمية HESS2 وHESS3 علامات خط 129 / 01A، أي شريك المحفزة. وكان الاستثناء كروموسوم 1 و I: استنساخ HESS2 وHESS3، جنبا إلى جنب مع علامات HM-1 الخلايا، وعدد قليل من علامات الحاضر شريك الجسدية. قد تعكس هذه النتائج الفصل غير الكامل للصبغيات (1) ووالشريك الجسدية وتتفق مع البيانات الوراثية الخلوية التي تريسمي من الكروموسومات التي تحدث في 30-40٪ HESS2 واستنساخ الخلايا HESS3. اختلف HESS4 استنساخ بشكل كبير في تكوين الكروموسومات: العديد من الجسمية هذا استنساخ نشأت من الجينوم ESK (الكروموسومات 2، 3، 4، 5، 6، 7، 10، 13، 14 و 17)، ولكن الكروموسومات 1، 9، 11، 12، وعرضت 15 و 16 و 18 و 19 homologs من كلا الوالدين. نسبة كمية من الواسمات الوراثية يتفق هذه الكروموسومات المتجانسة حوالي 1: 1. يسمح هذا الكتاب تشير إلى أن homolog واحد مشتق من جينوم ESC، والآخر - من الخلايا المتمايزة. في بعض subclones من استنساخ احظ HESS4 تواجد رمزي فقط من الكروموسومات 18 و 19 شريك الجسدية. وتشير النتائج إلى أن الخلايا استنساخ HESS4، بالإضافة إلى فصل الكروموسومات الشريك الجسدية، كان هناك القضاء على واحد أو كلا homologs من المحفزة الجينوم الكروموسوم أعلاه، أي كان هناك فصل الوجهين من الكروموسومات لكلا الوالدين - وهذه ظاهرة غير عادية جدا، لأن tsitogibridov الفصل المميز من الكروموسومات فقط أحد الوالدين.

وبالإضافة إلى ذلك، وبعد مرور ال20، جميع الحيوانات المستنسخة من الخلايا الهجينة تحتوي فقط على علامات X كروموسوم الشريك الجسدية، وهذا هو، في استنساخ تم استبدال X كروموسوم ESC على الكروموزوم (اكس) الشريك الجسدية. تؤكد هذه الحقيقة البيانات الهامة في الموقع التهجين باستخدام المسبار المسمى FITC محددة للكروموسوم X ماوس: تم الكشف عن إشارة إيجابية فقط على كروموسوم واحد. لاحظ أنه في توقيت سابق من زراعة (حتى مرور ال15) وفقا البيانات الوراثية الخلوية الحالية اثنين X الكروموسومات في العديد من الخلايا. ونتيجة لذلك، واستخدام وسائل الإعلام الانتقائي يسمح لك لمعالجة تكوين الكروموسومات من الخلية المختلطة وإخراج لتحديد استنساخ يحمل كروموسوم واحد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الشريك الجسدية في الجينوم الخلفية.

كميزة فريدة من tsitogibridov الجينوم هو توطين الجينوم الوالدين في جوهر واحد، بالطبع، يثير مسألة الحفاظ على خصائص الجينوم الجنينية الهجينة الخلايا المحفزة ESC-جسدية في ظروف اتصال وثيق مع جينوم الخلايا المتمايزة. شكليًا ، تشبه الخلايا السيتوأمينية للـ ESC والخلايا الجسدية الخط الأبوي لـ ESC. وأظهرت التأهيل تعدد القدرات أن جميع الحيوانات المستنسخة okolodiploidnym مجموعة من كانت قادرة على تشكيل الثقافات في تعليق الهيئات مضغي فيها مشتقات من طبقات جرثومية ثلاثة الحاضر الكروموسومات.

احتوت معظم الخلايا الهجينة المستضد ECMA-7 ، وهو علامة مميزة لأجنة الفئران المبكرة ، وكان لها أيضًا نشاط عالي من الفوسفاتاز القلوي. تم الحصول على البيانات الأكثر إقناعا على خصائص متعددة القدرات من الخلايا الهجينة في التجارب للحصول على سلسلة من chimeras حقن تنطوي على خلايا هجينة من استنساخ HESS2. أظهر تحليل للعلامات البيوكيميائية أن أحفاد الخلايا الهجينة المانحة وجدت في معظم أنسجة الخيميرا. وبالتالي ، فإن الخلايا الهجينة التي تم الحصول عليها عن طريق دمج الـ ESC والخلايا المتميزة الجسدية تحافظ على تعدد القدرات على مستوى عالٍ ، بما في ذلك القدرة على تشكيل الكيمرات عند إدخالها في تجويف الكيسة الأريمية.

اختلف Clones HESS2 و HESS4 بشكل كبير في تكوين الكروموسومات الأصلية ، ولكن كان لهما خصائص متعددة القدرات مماثلة. ربما نستطيع أن نفترض أن plyuripotentnostv "في الجينوم الهجين يتجلى كعلامة المهيمن، ولكن من الممكن أن ليس كل من الكروموسومات الجينوم الجنينية وتشارك في الحفاظ على تعدد القدرات. إذا كان هذا الافتراض صحيحا، فإنه يمكن توقع أن القضاء على بعض الكروموسومات شريك المحفزة من جينوم الخلايا الهجينة لا يرافقه تغيير في وضعهم المحفزة. في هذه الحالة، فإن تحليل الفصل بين كروموسوم الوالدين في الخلايا الجنينية الهجين يسمح للاقتراب من تحديد الكروموسومات المسؤولة عن السيطرة على تعدد القدرات من الخلايا الجنينية.

سيروف O. وآخرون (2001) وجدت بين ذرية 50 تم الحصول عليها من الصلبان من الوهم مع الفئران العادية، وتلك التي سيكون لها الوراثي الفئران 129 / 01A، ويحمل كروموسوم X الفئران DD. يرى المؤلفان سبب ذلك في الحد من تعدد القدرات في الخلايا الهجينة تحت تأثير الجينوم الجسدي. تفسير بديل قد يكون التأثير السلبي للتثلث الصبغي لبعض الخلل في الجسمية والكروموسومات الجنسية (XXY لوحظ في الخلايا حتى مرور ال15) في الخلايا الهجينة في مرور الانقسام الاختزالي. من المعروف أن خلايا XXY لا يمكن أن تمر عبر الانقسام الاختزالي وتشكل الأمشاج. التثلث الصبغي هي أيضا قادرة على أن تسبب انخفاضا في النشاط التكاثري من الخلايا الهجينة، مما أدى إلى ميزة انتقائية في تطوير الوهم قد تنتمي إلى خلايا الجنين المتلقي. ويترتب على ذلك أنه لإجراء تقييم كافٍ للإمكانات متعددة القدرات للخلايا المهجنة ، من الضروري الحصول على نسخ مستنسخة مختلطة مع مجموعة مضاعفة طبيعية من الكروموسومات.

في التجارب Serova O. وآخرون (2001) أثبتت لأول مرة إمكانية إعادة برمجة X كروموسوم في الجينوم من خلية خلية الهجين الجسدية. هذا الاستنتاج التالي من المؤلفين تحليل التعبير عن الجينات الوهم hprt (X كروموسوم علامة): وجود أليلية المتغيرات تم الكشف عن hprt DD / ج الفئران في جميع الأنسجة تحليلها خيالية. وينبغي التأكيد على أنه بعد إدخال الخلايا الهجينة في تجويف الكيسة tsitogibridy تقع في ظروف غير انتقائية والحفاظ على الكروموزوم (اكس) في جينوم الخلايا الهجينة يعني أنه أصبح عنصرا يلزم من الجينوم، ولا يميز ذلك من Y شريك كروموسوم المحفزة.

تلخيص نتائج تحليل التفاعل بين الجينوم الجسدية والمحفوفة في الخلايا الجنينية الهجينة ، وخلص الباحثون إلى أن في بعض cytohybrids يتجلى تعدد القدرات في حد ذاته كصفة مهيمنة. الجين هجين قادر على الكروموسومات الفردية إعادة برمجة خلايا متمايزة، التي، مع ذلك، لا يستبعد تأثير عكسي على تعدد القدرات الجسدية الجينوم الجينوم الجنينية. في زراعة الخلايا الهجينة ، يحدث تحريض التمايز في كثير من الأحيان أكثر من خط الأصل الأصلي لـ ESC NM-1. لوحظ تأثير مماثل في تكوين المستعمرات الأولية: العديد من المستعمرات الأولية للخلايا الجنينية الهجينة تميز في المراحل المبكرة من التكوين مع فقد كبير من الحيوانات المستنسخة أثناء اختيارها والضرب.

وهكذا، tsitogibridy من اندماج ESC مع الخلايا الجسدية، على الرغم من اتصال وثيق مع جينوم الخلايا المتمايزة الاحتفاظ تعدد القدرات كميزة فريدة من الجينوم الجنينية. علاوة على ذلك ، في مثل هذه الخلايا الهجينة ، من الممكن إعادة برمجة الكروموسومات الفردية الناشئة من الخلايا المنتشرة. ولم يتضح بعد كيف حفظت جيدا خصائص ripotentnye plyu- من الجينوم الجنينية في الخلايا الهجينة، على وجه الخصوص، قدرتها على المشاركة في تشكيل الوهم خط الجرثومية. لهذا ، فمن الضروري الحصول على الخلايا الهجينة الجنينية مع النمط النووي العادي. في أي حال، يمكن للخلايا الجنينية الهجينة المحفزة يكون نموذجا حقيقيا لتحديد الهوية الوراثية للكروموسومات المعنية في الحفاظ على تعدد القدرات أو السيطرة عليها كما فصل الثنائي من الكروموسومات الأبوية يحتمل أن يوفر مثل هذه الفرصة.

لا أقل جاذبية هي ظاهرة الدراسة، التي سيروف G. وآخرون (2001) الذي يعرف بأنه "ذاكرة الكروموسومات." في الجينوم الهجين الكروموزومات المتماثلة هما تكوينات بديلة: المتماثلات الجسدية شريك مرة واحدة مرت التمايز، في حين homologs شريك المحفزة، وهذه العملية هي مجرد بداية. لذلك، والحفاظ على الخصائص المحفزة عالية من الخلايا الهجينة يشير إلى أن "المحفزة" المتماثلات التكوين ESC مستقرة إلى حد ما في الجينوم المختلطة، على الرغم من تأثير العوامل transdeystvuyuschih المنبثقة عن الشريك الجسدية. الميزات المذكورة أعلاه من إعادة برمجة متباينة الصبغيات الجينوم مثلي خلال تطوير الوهم لا تستبعد احتمال أن المراحل الأولى من تكوين في المختبر، وزراعة tsitogibridov أنها تحتفظ ضعهم المكتسبة خلال التمايز في الجسم الحي. ووفقا للبيانات الأخيرة، عندما نقل الخلايا الجنينية الهجينة في وسط غير الانتقائي التي يوجد فيها شريك الجسدية الكروموسومات القضاء الوحيد المكثف، أي جينوم الخلايا الهجينة تميز بسهولة homologs بعد في المختبر الثقافة لمدة 10-15 الممرات. وهكذا، والخلايا الجنينية المختلطة تمثل نموذج تجريبي واعد للدراسة ليس فقط من الخصائص الأساسية للجينوم الجنينية كما تعدد القدرات، ولكن أيضا بدائلها - التمايز الجنينية.

الفعالية العلاجية لزرع الخلايا الجذعية الجنينية

قبل تحليل الكفاءة العلاجية لزرع ESC ومشتقاتها ، نلخص المواد المذكورة أعلاه. يتميز ESC من حيث التنفيذ الكامل للمرحلة التطور الجنيني في المختبر هي غير كافية بسبب عيوب في هذه الحالة نظرا لعدم وجود الخلايا الجذعية الوسيطة التي تحدث في الجسم بشكل مستقل وبمعزل عن hESCs. القوة الوراثية لل ESC أقل من الإمكانات الوراثية للميجوت ، لذلك لا تستخدم مباشرة لاستنساخ الأجنة. إن الإمكانات البيولوجية الفريدة لـ ESC كخلايا الوحيدة التي يتم فيها نشر برامج التطوير في التنفيذ المتسلسل الكامل ، تجد التطبيق في دراسات حول وظيفة الجينات. مع مساعدة من ESC ، يتم فك رموز أول مجموعات من الإشارات التي تنشط التعبير عن الجينات المبكرة والمتأخرة ترميز تطوير ثلاث أوراق جنينية. إن الحفاظ على تعدد القدرات في الجينوم ESC في المختبر يجعلها أداة فريدة من نوعها للتجديد التعويضي ، قادرة على تجديد الخسائر الخلوية تلقائياً في الأضرار التي تلحق بالأعضاء والأنسجة. في تجسيد افتراضية مثالية يمكن أن نفترض أن "... في زرع بغتش المانحة في الكائن المتلقي يتم نقل البرامج حزم مضغوط أن تتحقق في ظل ظروف مواتية في بناء tkani'7 جديد قادر" ... متكاملة على نحو فعال في جسم المتلقي بأنها شكلية، كلا الوظيفية والوظيفية ".

وبطبيعة الحال ، في أعقاب تطوير أساليب التفرقة الأحادية للمادة ، بدأت الدراسة الحية للنشاط الوظيفي للخلايا التي تم الحصول عليها في المختبر من استنساخ واحد متخصص. يولد استنساخ ESO المتكاثر مجموعات من الخلايا السلف المهاجرة التي تكون قادرة فعلاً على الاندماج بفعالية في مناطق تلف الأنسجة في المستلم ، والتي تستخدم في الطب التجديدي البلاستيكي. وقد ثبت أن زرع الخلايا العصبية الدوبا في المادة السوداء يقلل من المظاهر السريرية في hemiparkinsonianism التجريبية. تؤدي عمليات زرع الخلايا المانحة العصبية على المستوى الإقليمي إلى تقليل درجة الاضطرابات الحركية الناجمة عن الصدمة أو كدمة في الحبل الشوكي والدماغ. تلقى والنتائج الإيجابية الأولى لزرع الخلايا الجذعية في أمراض إزالة الميالين. يبدو أن قدرات التجدد-البلاستيك من المجالس الاقتصادية والاجتماعية تفتح إمكانيات غير محدودة لاستخدام الزراعة الخلوية في الطب العملي. ومع ذلك ، عندما زرع في المناطق خارج الرحم ، والمجال الاقتصادي والاجتماعي لا محالة تتحول إلى الأورام. عندما يتم تشكيل حقن تحت الجلد من ESC في teratomas الفئران العوز المناعي. عندما زرع تحت الخصية ESK كبسولة الطين في الفئران مسانج أيضا يتم تشكيل مسخي المبيض تتكون من الأنسجة المختلفة، والخلايا التي هي مشتقات من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. في هذه المسخيلات ، تكون عمليات انخفاض عضوي المنشأ نادرة للغاية.

يقدم عدد من الأعمال معلومات عن النتائج الإيجابية لزراعة مشتقات مبكرة من ESCOs للحيوانات التي لديها علم الأمراض السابق. Neurotransplantation الخلية باستخدام مشتقات بغتش ومزيد من التطوير في التجربة والتجارب السريرية الأولى على تصحيح اضطرابات وظيفية في المخ وصدمة الحبل الشوكي، علاج تكهف النخاع والتصلب المتعدد (ريبين، 2001). مع ظهور المجالس الاقتصادية والاجتماعية neyronogeneza التكنولوجيا في المختبر، بدلا من استخدام تقنيات زرع أنسجة المخ الجنينية وضعت مشتقات neurospheres، تم الحصول عليها من ثقافات الأنسجة العصبية الجنينية. مثل هذه الإزاحات المزروعة هي أكثر تجانسا بكثير وتحتوي على سلائف عصبية وعصبية ملتزمة.

بالإضافة إلى مستنبت منتظمة مع حمض الريتينويك بجرعة من 10 ميكروغرام / مل لمدة 6 أسابيع في خطوط الجنينية (مسخي المبيض) NTERA-2 -kartsinomy الإنسان شكلت أكثر من 80٪ من الخلايا العصبية بعد الإنقسامية. ويتم تحقيق التجانس التام من السكان الخلايا العصبية عن طريق التدفق فرز علامات immunophenotypic المسمى من الخلايا العصبية الناضجة التي يمكن أن تخلص من بقايا teratokartsinomnyh وخلايا غير ناضجة. بعد الزرع في مناطق مختلفة من دماغ الحيوانات التجريبية ، لا تنجو هذه العصبونات فحسب ، بل تبنى أيضاً في الشبكات العصبية الإقليمية. في الحيوانات مع نماذج تجريبية من العيوب المحلية CNS neurotransplantation يقلل المظاهر السريرية للأمراض البشرية مثل آثار الصدمة الجمجمة، والسكتة الدماغية، وأمراض المزيل، وعيوب تطوير المخيخ وراثية، وأمراض ترسب الدهون والسكريات.

لتحسين عمليات إعادة التأهيل في الأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي ، يتم تطوير تقنيات لإعداد الخلايا قليلة التغصن المنتجة للمايلين من ESK. تتضمن المرحلة الأولى تقليديا تكاثر المجالس الاقتصادية والاجتماعية مع تكاثر عدد الخلايا اللازمة للزراعة. في المرحلة الثانية ، يتم إجراء تباين موجّه للخلايا في مجموعة من السلائف النيغازية المتولدة المنتجة للمايلين ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة مستضدات تحديد انتقائية.

يتم فتح بعض الآفاق للمشتقات استخدام المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتطوير أساليب لتصحيح نقص المناعة الناجمة عن عيوب وراثية في نضوج الغدة الصعترية. في دراسات في دور الستة عشر (خرقة 1) الفئران مع خلل الجينات التي يسببها - انتهاك آلية إعادة التركيب V (D) مواضع J الجينات TCR، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة الخلايا اللمفاوية التائية، وزرع المشتقات الأولى من بغتش في الغدة الصعترية الحيوان يسترد نضوج السكان الطبيعي من الحيوانات المستنسخة المناعية المسؤولة عن الخلية بوساطة الحصانة. التجارب السريرية زرع متشكلة في hESCs المختبر لعلاج فقر الدم وراثي مميت عند الأطفال.

تبرر الاعتراضات على الإدخال السريع لزراعة الخلايا الجذعية في العيادة من خلال عدد محدود من الخطوط المستقرة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية والحاجة إلى توحيدها. لزيادة نقاء خطوط ESC القياسية ، بالإضافة إلى الخلايا الجذعية البالغة ، يُقترح استخدام طريقة اختيار الخط بناءً على التحليل الجيني الجزيئي للتكرارات الترادفية القصيرة للحمض النووي. من الضروري أيضًا اختبار خطوط ESC من أجل إعادة ترتيب الكروموسومات الصغيرة والطفرات الجينية ، والإمكانية المحتملة لحدوثها في ظل ظروف زراعة الخلايا عالية بما فيه الكفاية. أطروحة تمتد إلزامية اختبار خصائص جميع أنواع بغتش والخلايا الجذعية المحفزة الإقليمية، منذ انتشارها في المختبر يمكن أن تؤدي إلى خصائص جديدة لا المتأصلة في الخلايا الجذعية الجنينية إلى نهائي أو الأنسجة. على وجه الخصوص، فمن المفترض أن زراعة على المدى الطويل في وسائل الإعلام مع السيتوكينات هيس أقرب إلى الخلايا السرطانية، لأنها تحدث مسارات التغيير مماثلة تنظم دورة الخلية مع اكتساب القدرة على تنفيذ عدد غير محدود من الانقسامات الخلوية. بعض الكتاب ، على أساس إمكانية تطور الأورام ، يعتبرون أن زرع الإنسان للمشتقات المبكرة للخلايا الجذعية الجنينية هو تهور. في رأيهم ، هو أكثر أمانا بكثير لاستخدام الأحفاد الملتزمين من ESC ، وهذا هو ، خطوط أسلاف الخلايا المتمايزة. ومع ذلك ، لم يتم بعد تطوير تقنية موثوقة للحصول على خطوط خلايا بشرية مستقرة تميز في الاتجاه الصحيح.

وهكذا ، في الأدب هناك المزيد والمزيد من البيانات عن التأثير العلاجي الإيجابي لزراعة مشتقات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأعمال تخضع للمراجعة والنقد. يعتقد بعض الباحثين أن نتائج التجارب السريرية المبكرة هي نتائج أولية في الطبيعة وتشير فقط إلى أن الخلايا الجذعية يمكن أن يكون لها تأثير مفيد على المسار السريري للمرض. لذلك ، من الضروري الحصول على بيانات حول النتائج طويلة المدى لزراعة الخلايا. كحجة ، يتم إعطاء مراحل تطور زرع الأعصاب السريري. في الواقع، في الأدب، ويهيمن عليها في البداية عن طريق نشر كفاءة عالية من زرع الدماغ وأجزاء من الأجنة في مرض الشلل الرعاش، ولكن بعد ذلك بدأت تظهر تقارير ينكر الكفاءة العلاجية من الأنسجة العصبية الجنينية أو الجنين زرعها في أدمغة المرضى.

أجرى التجارب السريرية الأولى تقييم سلامة أرومة عصبية زرع - مشتقات بغتش NTERA-2 سرطانة مسخية، تعرض خلايا غير ناضجة التي تتكاثر في الثقافة لتخزين 100 مليون كتلة الخلية. وقد استخدم جزء من الخلايا وبالتالي الحصول على لتحديد خصائص النمط الظاهري خلية والشوائب، وكذلك لاختبار تلوث محتمل من قبل الفيروسات والبكتيريا. من تمت إزالة مستنبت LIF والطبقة المغذية للخلايا انسجة والظروف الناشئة الجنين للتمايز موجهة من hESCs في neuroblasts مع مزيج من السيتوكينات وعوامل النمو. بعد ذلك ، تم تنقيته من الخلايا العصبية غير الخاضعة للذاكرة tatocarcinoma على فارز قفص التدفق. بعد تنقية الثانية وتوصيف النمط الظاهري من neuroblasts الخلايا المزروعة (10 حتي 12000000) تعليق باستخدام حقنة وmicrocannulas الخاصة جراحة التوضيع التجسيمي وتحت سيطرة CT حقنه في القاعدي نواة الدماغ من المرضى (الشهر السابع بعد السكتة الدماغية النزفية). Odnogodovoy بعد زرع فحص آثار زرع الخلايا العصبية في منطقة في المخ كشف أي آثار سلبية وغير المرغوب فيها. شهدت نصف المرضى تحسنا في وظيفة الحركة في الفترة من 6 إلى 12 شهرا بعد الزرع. ورافق التغيرات السريرية الإيجابية بزيادة في منطقة السكتة الدماغية إمدادات الدم بعد زرع الخلايا: زيادة امتصاص متوسط من 2 deoxyglucose مضان المسمى، وصلت وفقا التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني 18٪، وفي بعض المرضى - 35٪.

ومع ذلك ، أجرى المعهد الوطني الأمريكي للصحة دراسة مستقلة عن الفعالية السريرية لزراعة الأعصاب في مرضى الشلل الرعاش. تم زرع المرضى في المجموعة الأولى مع الأنسجة العصبية الجنينية المنتجة للدوبامين ، في حين خضعت المجموعة الثانية من المرضى لعملية خاطئة. تشير النتائج إلى فعالية سريرية صفرية لمثل هذه العملية العصبية ، على الرغم من حقيقة أن الخلايا العصبية الجنينية المنتجة للدوبامين نجت في دماغ المتلقين. وعلاوة على ذلك، بعد بعد زرع الأنسجة العصبية الجنينية في 15٪ من المرضى 2 سنة وضعت خلل الحركة المستمرة، والتي هي غائبة في المرضى في المجموعة الثانية (خلايا الجذعية: التقدم العلمي واتجاهات البحوث في المستقبل نات انست، الصحة USA ...). تستمر ملاحظات تطور المرض في هؤلاء المرضى.

ويعزو بعض الكتاب الأدب متناقضة على تقييم البيانات فعالية Neurotransplantation السريرية مع اتباع نهج مختلف لاختيار مجموعة من المرضى، وعدم كفاية اختيار الأساليب الموضوعية لتقييم حالتهم، والأهم من ذلك، حيث مختلفة من تطور النسيج العصبي الجنين وفي أجزاء مختلفة من الدماغ الذي تم إنتاج النسيج في مختلف الأحجام الزرع والسمات المنهجية للجراحة.

وتجدر الإشارة إلى أن محاولات لتوجيه زرع الخلايا الجذعية الجنينية المحفزة في منطقة الجسم المخطط من دماغ الفئران مع gemiparkinsonizmom الجسم التجريبية رافق ESC انتشار والتمايز بهم إلى الخلايا العصبية الدوبامين. يجب الافتراض أن الخلايا العصبية التي شكلت حديثا بنيت بشكل فعال في الشبكة العصبية كما المجالس الاقتصادية والاجتماعية بعد زرع وحظ تصحيح الشذوذ في السلوك وعدم التماثل السيارات في اختبار آبومورفين. في الوقت نفسه ، توفي بعض الحيوانات بسبب تحول ESK المزروع في ورم الدماغ.

خبراء من الأكاديمية الوطنية و طب الولايات المتحدة، والمتخصصين من المعاهد الوطنية للصحة ويعتقد أن إمكانات سريرية من hESCs تستحق اهتماما جديا، ومع ذلك، يصر على ضرورة إجراء دراسة مفصلة لممتلكاتهم، واحتمال حدوث مضاعفات وآثار طويلة الأجل في التجارب مع نماذج البيولوجية كافية من الأمراض التي تصيب الإنسان (خلايا الجذعية و الطب التجديدي المستقبلي National Academy Press، Stem cells واتجاهات البحوث المستقبلية.، Nat. Inst، of Health USA).

من وجهة النظر هذه من المهم أن التحليل النسيجي المقارن من مسخي التجريبية التي حصل عليها زرع في بغتش الطين الخصية مع مسخي المبيض التي وضعت نتيجة لزرع الجنين في وقت مبكر، والتي تضمنت أيضا أظهر الحالي ESC أن ESK بغض النظر عن أصلهم أو التفاعل مع من خلال تلك الخلايا أو غيرها من الخلايا المحيطة بنفس الطريقة تحقيق قدراتهم الورمية. وثبت أن هذه مسخي المبيض لها أصل نسيلي، كما من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الورم قد تحدث، والتي تتكون من مشتقات جميع الطبقات الجرثومية الثلاث (.Rega، 2001). ومن الجدير بالذكر أنه عندما زرعها في الفئران العوز المناعي المستنسخة بغتش مع النمط النووي العادي ومسخي المبيض شكلت تتكون من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الجسدية متباينة. هذه البيانات التجريبية هي الدليل المثالي على الأصل النسيلي للتتروم. من منظور علم الأحياء التطوري، فإنها تشير إلى أنه ليس من مضاعفات الرقم الخلايا الاولية ملتزمة وهوية الخلايا الجذعية المحفزة هي مصدر للمشتقات متباينة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث، مكونات مسخي. ومع ذلك، في العملية نتائج زرع الخلايا من هذه الدراسات، إن لم يكن باهظة، ثم علامة تحذير من خطر محتمل، لESC التلقيح أو الخلايا الجرثومية البدائية في أنسجة مختلفة من الفئران العوز المناعي الكبار يسبب حتما نمو الاورام من الخلايا الجذعية المزروعة. انحطاط الأورام زرع ectopically ESC يرافقه ظهور السكان الأقمار الصناعية من خلايا متمايزة - عن طريق التفريق جزئيا هو بالتأكيد المجالس الاقتصادية والاجتماعية واستنساخ السلف مخصصة خطوط. ومن المثير للاهتمام أن hESCs زرع في خلايا العضلات والهيكل العظمي بالقرب teratokartsinomnymi الخلايا العصبية تشكل في كثير من الأحيان. ومع ذلك، في بغتش إدارة الصولجان البيض أو الكيسة يرافقه الاندماج الكامل في الخلايا الجرثومية دون تشكيل خلايا الأورام. وفي الوقت نفسه ESC جزءا لا يتجزأ من الأعضاء والأنسجة وكلها تقريبا من الجنين، بما في ذلك رديم الجنسية. وبإخضاع الخلية سرطانة مسخية 129 في المراحل المبكرة للأجنة في 8-100 خلايا أعدت هذه الحيوانات allofennye أولا. في allofennyh السكان الفئران يتم تقديم geterogenomnyh المشتقة من خلية بغتش المانحة في نخاع العظام والأمعاء والجلد والكبد والأعضاء التناسلية، والتي تسمح لك بإنشاء في التجربة حتى بين الأنواع الوهم الخلية. أصغر وقت الجنين في وقت مبكر، وارتفاع نسبة chimerization الخلية، وهو أعلى مستوى chimerization درجة لوحظت في نظام المكونة للدم، والجلد والجهاز العصبي والكبد والأمعاء الدقيقة allofennogo الجنين. في الكائن الحي الكبار chimerization قابلة الأنسجة حمايتها من التعرض للنظام المناعي للحواجز gistogematicalkie المتلقي: زرع الخلايا الجرثومية البدائية في لحمة الخصية مصحوبا الإدراج الخلايا الجذعية المانحة في الطبقة المستفيدة الأنسجة germenativny. ومع ذلك، لا يحدث ESC زرع في تشكيل الكيسة الأعضاء التناسلية براعم خيالية مع الجيل المانحة الخلايا الجرثومية البدائية. ESC تعدد القدرات عند تهيئة الظروف الخاصة، ويمكن استخدامها لاستنساخ: ESC زرع الفئران 8-16 خلايا الفأر الجنين، الانقسام الخلوي حيث tsitokalazinom المحظورة، يساهم في التطور الجنيني الطبيعي مع تطور الجنين بغتش المانحة.

ونتيجة لذلك، بديل هو زرع خيفي الاستنساخ العلاجي ESC على أساس زرع نواة الخلية الجسمية في بويضة منزوعة النواة لخلق الكتلة الخلوية الداخلية الكيسة التي ثم يتم تخصيص خط بغتش المانحة متطابقة وراثيا نواة جسدية. من الناحية التقنية، هذه الفكرة هي مجدية، لأن إمكانية إنشاء خطوط HESC من الكيسات الأريمية التي تم الحصول عليها بعد زرع نواة جسدية في خلية بويضة منزوعة النواة ثبت مرارا وتكرارا في التجارب على الحيوانات المختبرية (ناجي، 1990؛ Munsie، 2000). ولا سيما في الفئران متماثلة اللواقح بالنسبة للطفرة rag2، الليفية التي حصلت عليها زراعة استخدمت خلايا الأنسجة تحت البشرة حيث يتم زرع نواة المانحة إلى البويضات منزوعة النواة. بعد التنشيط، البويضات "اقحة" مثقف حتى تشكيل الكيسة، من الكتلة الخلوية الداخلية هو بغتش معزولة وتمريرها إلى خط للخلايا nullizigotnyh الجينات الطافرة (rag2 ~ / ~). من خلال إعادة التركيب المتشابه في مثل هذه المجالس ، تم تصحيح طفرة جين أليل واحد. في السلسلة الأولى من التجارب من hESCs استرداد الجينات المؤتلف وأعدت الهيئات مضغي، transfected خلايا منها مع الارتجاعي المؤتلف (HoxB4i / GFP) وبعد حقن الفئران نشر في الوريد rag2 ~ / ~. في السلسلة الثانية عن Blastomeres رباعي الصيغة الصبغية تجميعها مع hESCs المعدلة وراثيا والمزروعة منها إلى أنثى المتلقي. وكانت الفئران مناعيا ولد المانحين نخاع العظم للزراعة متحولة rag2 الفئران ~ / ~. في كل سلسلة، وكانت النتيجة إيجابية: 3-4 أسابيع في كل الفئران من خلايا الدم النخاعي واللمفاوية ناضجة العادية تم العثور قادرة على إنتاج المناعية. وهكذا، وزرع في نواة البويضة من الخلايا الجسدية يمكن استخدامها ليس فقط لإنتاج خطوط HESC، ولكن أيضا لtsitogenoterapii - تصحيح تشوهات وراثية باستخدام ESC كناقل لنقل تصحيح المعلومات الوراثية. ولكن في هذا الاتجاه لزرع الخلايا ، بالإضافة إلى مشكلات الأخلاقيات البيولوجية ، هناك قيود. وليس من الواضح مدى سلامة زرع سيتم استنساخ علاجي الخلايا مع راثى متطابقة إلى التركيب الوراثي للمريض معين، لأن مثل هذه الخلايا يمكن إدخال الطفرات التي تخلق نزعة إلى بعض الأمراض. تبقى البويضات البشرية العادية كائن لا يمكن الوصول إليها، في حين حتى عندما زرع نواة جسدية إلى بويضة منزوعة النواة الحيوان٪ فقط 15-25 المهندسة "اقحة" تطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية. لم يتم تحديد مقدار الكيسة الأريمية المطلوبة للحصول على خط واحد من المجالس الاقتصادية متعددة القدرات المستنسخة متعددة القدرات. وتجدر الإشارة إلى المستوى العالي من التكاليف المالية المرتبطة بتعقيد منهجية الاستنساخ العلاجي.

في الختام، في تعدد القدرات الجينوم ESC hypomethylated DNA يتم دمجها مع النشاط تيلوميراز عالية والمرحلة C ^ دورة الخلية قصيرة، والتي تضمن الضرب المكثف ويحتمل أن تكون لانهائية، وخلالها بغتش تحتفظ الكروموسومات مضاعفا و "الحدث" مجموعة من الصفات المظهرية. نمو نسيلي من بغتش في الثقافة لا يمنعها تفرق في أي خلية متخصصة للكائن الحي في انتشار توقف خط وإضافة إشارات التنظيمية المناسبة. ويتحقق التمايز تقييد hESCs في خط في خلية جسدية المختبر دون مشاركة من اللحمة المتوسطة، وتجاوز Nohteyaov، هو توالد ودون تشكيل الجنين. حمل خارج الرحم في الجسم الحي إدارة بغتش يؤدي حتما إلى سرطانة مسخية تشكيل. ESC زرع في الكيسة أو الجنين في وقت مبكر يرافقه اندماجها مع أنسجة الجنين والهيئات chimerization المستقرة.

تقنيات التجدد والبلاستيك على أساس زرع الخلايا هي نقطة تقاطع مصالح أعضاء بيولوجيا الخلية والبيولوجيا التطورية، وعلم الوراثة التجريبية، علم المناعة، والأمراض العصبية، وأمراض القلب، أمراض الدم، والعديد من المجالات الأخرى من الطب التجريبي والعملي. النتائج التجريبية أهم تثبت إمكانية إعادة برمجة الخلايا الجذعية مع اتجاه التغيير من ممتلكاتهم، والذي يفتح آفاقا للسيطرة على عمليات تمايز خلوي مع عوامل النمو - لتجديد عضلة القلب، واستعادة آفات الجهاز العصبي المركزي وتطبيع وظيفة الجهاز جزيرة البنكرياس. ومع ذلك، فإن على نطاق واسع المشتقات زرع مقدمة ESC في الممارسة الطبية من الضروري التحقيق في خصائص الخلايا الجذعية البشرية في مزيد من التفاصيل والمزيد من التجارب مع بغتش في نماذج تجريبية من الأمراض.

قضايا أخلاقيات العلوم الحيوية ومشكلة رفض زرع الخلايا خيفي يمكن أن تحل اللدونة المرصودة للجينوم الخلايا الجذعية البالغة الإقليمية. ومع ذلك، فإن المعلومات الأولية هي أنه عندما زرع الكبد الخلايا المكونة للدم ذاتي معزولة، وتميزت بدقة، التي يوجد منها خلايا الكبد جديدة، وتتضمن في الفصيصات الكبدية، ويجري حاليا مراجعة وانتقاد. ومع ذلك، نشرت البيانات إلى أن زرع الخلايا الجذعية العصبية في الغدة الصعترية هو تشكيل براعم جديدة من المانحين T-وB-الخلايا الليمفاوية، وزرع الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ في نخاع العظام ويؤدي إلى تشكيل للدم الجرثومية حقت النخاعي المانحة والكريات الحمر . ونتيجة لذلك، في أجهزة الكبار يمكن الحفاظ على الخلايا الجذعية المحفزة قادرة على إعادة برمجة الجينات من ESC للقدرات.

مصدر المجالس الاقتصادية والاجتماعية للاستخدامات الطبية يبقى الجنين البشري، الذي سلفا حتمية معبر جديد من القضايا المعنوية والأخلاقية والمعنوية والقانونية والدينية في أصل الحياة البشرية. أعطى اكتشاف المجالس الاقتصادية والاجتماعية دفعة قوية لاستئناف المناقشات القاسية حول أين يكمن الخط الفاصل بين الخلايا الحية والمادة والجوهر والشخصية. في الوقت نفسه ، لا توجد قواعد وقواعد وقوانين عالمية فيما يتعلق باستخدام ESC في الطب ، على الرغم من المحاولات المتكررة لإنشاء وقبولها. كل دولة ضمن تشريعاتها تحل هذه المشكلة بمفردها. من جانبهم، والأطباء في جميع أنحاء العالم الاستمرار في محاولة لجلب الطب التجديدي، والبلاستيك وراء مثل هذه المناقشات، ويرجع ذلك أساسا إلى استخدام الخلايا الجذعية الجنينية غير ووقف احتياطيات خلية بالغة.

بعض من تاريخ عزل الخلايا الجذعية الجنينية

تم عزل المسخ (الجنين) الخلايا من -kartsinomnye بشكل عفوي تحدث الخصية سلالة مسخي المبيض الماوس 129 خلية / ثالثا-SV، عفوية المبيض خطوط مسخي المبيض الماوس الملازم / سيفرت، ومن مسخي المبيض، وقد تم زرع ektopichno المصدر أو الأنسجة الجنينية. ومن ثم الحصول على المسخ خطوط مستقرة الماوس (الجنين) -kartsinomnyh بعض الخلايا هي المحفزة، وتعرض آخرين للتمييز فقط في الخلايا من نوع واحد معين، وكانت بعض قادر عموما من تمايز خلوي.

في ذلك الوقت، كان التركيز على البحوث التي أظهرت المسخ ممكن عودة (الجنين) خلايا -kartsinomnyh إلى النمط الظاهري العادي بعد بدء العمل بها في أنسجة الجنين النامية، وكذلك العمل على إنشاء في المختبر المسخ المعدلة وراثيا (الجنين) -kartsinomnyh الخلايا ، بمساعدة أي فئران متحولة تم الحصول عليها للنمذجة البيولوجية لعلم الأمراض الوراثية البشرية.

لعزل المسخ خطوط (جنين) قد تم استخدامها في تكييف الهواء ثقافة تعليق خلية -kartsinomnyh. في المسخ الثقافة (الجنين) -kartsinomnye الخلايا، مثل المجالس الاقتصادية والاجتماعية، وتنمو لتشكيل هيئات مضغي وتحتاج إلى أن تترجم إلى خط التفكك ملزم الحفاظ على تعدد القدرات على طبقة المغذية من الخلايا الليفية الجنينية أو زراعة تعليق في وسائل الإعلام مشروط. المسخ الخلايا المحفزة (الجنين) - خطوط سرطان كبير، كروية، ولها نشاط عال من الفوسفاتيز القلوية، وحدات الشكل وقادرة على التمايز متعدد الاتجاهات. عندما قدم إلى الكيسة يتم تجميع مع morulae، مما أدى إلى تشكيل أجنة خيالية، في مختلف الأجهزة والأنسجة التي توجد فيها مشتقات المسخ (الجنين) خلايا -kartsinomnyh. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من هذه الأجنة خيالية يموت في الرحم، وأجهزة قيد الحياة الوهم الخلايا الغريبة حديثي الولادة، ونادرا ما اكتشفت ذات الكثافة المنخفضة. في نفس الوقت من حدوث الأورام (ليفية، العضلية المخططة، وأنواع أخرى من الورم الخبيث والورم الحميد البنكرياس) يزيد بشكل حاد، وانحطاط الأورام غالبا ما يحدث حتى في الرحم أجنة خيالية.

إن معظم خلايا الأجنة-سرطان الجنين في البيئة الدقيقة للخلايا الجنينية العادية تكسب بشكل طبيعي تقريبا خواص أورام خبيثة. ويعتقد أن الورم الخبيث لا رجعة فيه ويرجع ذلك إلى تفعيل الجينوم الورمي في عملية إعادة ترتيب الهيكلية. الاستثناء الوحيد هي خطوط الخلايا embriokartsinomnoy SST3، مسخي المستمدة من الخصية الفئران (خط 129 / SV-ثالثا)، والتي تظهر قدرة عالية على الاندماج في الأنسجة والأعضاء من الجنين دون تشكيل لاحقة من الأورام في الفئران خيالية. مشتقات من خطوط الخلايا الجنينية-مبتذلة في الفئران كميرا عمليا لا تشارك في تشكيل gonocytes الأولية. من الواضح، ويرتبط ذلك مع ارتفاع وتيرة شذوذ الكروموسومات المشتركة لمعظم المسخ (الجنين) خطوط -kartsinomnyh في الخلايا التي يحتفل به بوصفه عدم توازن الصبغيات أو شذوذ الكروموسومات.

في المختبر ، تم الحصول على عدة خطوط مستقرة من سرطان الأجنة-الجنين البشري ، تتميز تعدد القدرات ، النشاط التكاثري العالي والقدرة على التفريق مع النمو في الثقافات. على وجه الخصوص ، تم استخدام خط خلايا سرطان الأجنة-جنين الإنسان NTERA-2 لدراسة آليات التجلط العصبي العصبي. بعد زرع الخلايا من هذا الخط في المنطقة تحت البطنية من الدماغ الأمامي من الفئران حديثي الولادة ، لوحظ هجرتهم و neuronogenesis. وكانت هناك حتى يحاول زرع المسخ العصبية التي حصلت عليها زراعة الخلايا (الجنين) -kartsinomnoy خط NTERA-2، للمرضى الذين يعانون من السكتات الدماغية، والتي، وفقا للمؤلفين، مما يؤدي إلى تحسن سريري لهذا المرض. في الوقت نفسه ، لم تلاحظ حالات من الخلايا الخبيثة المزروعة من خط الأجنة - سرطان الجنين NTERA-2 في المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية.

تلقى إيفانز ومارتن الصفوف الأولى من الخلايا الجذعية الجنينية متعددة القدرات من مختلف الفئران في أوائل الثمانينيات من القرن الماضي ، وعزلها عن كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية ، وهي الأجنة. خطوط ESC المعزولة لفترة طويلة الحفاظ على تعدد القدرات والقدرة على التفريق إلى أنواع مختلفة من الخلايا تحت تأثير عوامل وسط خاص بالثقافة.

مصطلح "الجنينية الجذعية المحفزة خلية" ينتمي ليروي ستيفنز أن التحقيق في تأثير القطران التبغ على وتيرة التنمية الورم لفت الانتباه إلى وقوع سرطانة مسخية عفوية الخصية الخطي (129 / ت) من الفئران من المجموعة الضابطة. تميزت خلايا سرطانة مسخية الخصية بنسبة انتشار عالية، وبحضور السائل اليسار في تجويف البطن مع تشكيل التمايز عفوية من الخلايا العصبية، الخلايا الكيراتينية، غضروفية، العضلية، وكذلك الشعر والعظام شظايا، ولكن من دون أي إشارة من cytoarchitectonics أمر الأنسجة المناسبة. عندما زرع في زراعة الخلايا سرطانة مسخية نمت منفصل لاستنساخ المحفزة الركيزة وكان بعد ذلك تطفأ الهيئات مضغي شكلت وتعرض لالمنضبط الانشطار النووي تفرق في الخلايا العصبية، الدبقية والخلايا العضلية والعضلية. وجدت ستيفنز أن سرطانة مسخية الماوس 129 / ت يحتوي على أقل من 1٪ من خلايا قادرة على التفريق في مجموعة متنوعة من خط الجسدية المتخصصة، ونفسها التمايز يعتمد على العوامل التي تؤثر عليهم (تكوين السائل البريتوني، والمنتجات التي تم إضافتها إلى الثقافة من الخلايا أو الأنسجة الناضجة). يروي ستيفنسون الافتراض حول وجود بين خلايا سرطانة مسخية وأكد الخلايا الجرثومية الجنسية الاصلية الجنينية: تعليق أرومة مضغية خلايا الأجنة سابق للانغراس في الأنسجة الماوس الكبار تشكيل سرطانة مسخية، وفصل منها خطوط الخلايا النقية بعد تناوله داخل الصفاق الى ان الحيوانات المتلقي متباينة في الخلايا العصبية، العضلية وغيرها kletki جسدية مشتقات جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. في التجارب في زرع فيفو ESK (تم الحصول عليها من أرومة مضغية ولكن ليس الأرومة الغاذية) في أجنة فئران في مراحل مختلفة خطوط 8-32 قسيم أرومي المنتهية ولادة الحيوان خيالية (لا تشكيل ورم) في الأجهزة التي يكشف الأنسجة براعم المانحة. لوحظ الخيمرية حتى في خط الخلايا الجنسية.

الخلايا الجرثومية السلف الأساسي معزولة عن الماوس جنين جنين الجنس، والتشكل، النمط الظاهري المناعي والخصائص الوظيفية بما يتفق مع hESCs المستمدة من سرطانة مسخية ستيفنسون وأرومة مضغية. في الوهم ولدوا بعد إدارة hESCs في الكيسة، يتميز الجهاز allofenny التشكل الفسيفساء المانحة والمستفيدة بالتناوب الهيكلي وحدات وظيفية في الكبد والرئة والكلى. في عدد من الحالات ، لوحظ وجود كبدات معوية أو فصيصات الكبد ، تتكون في وقت واحد من الخلايا المتلقية والمتبرع. ومع ذلك ، دائمًا ما يحدث تحقيق التكون المرضي وفقًا للبرنامج الجيني للأنواع التي ينتمي إليها المتلقي ، وكان الخيميري يقتصر فقط على المستوى الخلوي.

ثم، فقد وجد أن انتشار hESCs دون تمايز خلوي على تغذية خلايا اللحمة المتوسطة المستمدة من طبقة (الخلايا الليفية الجنين) يحدث في وجود LIF ملزمة في وسائل الإعلام الغذائية الانتقائية التي توفر بشكل انتقائي البقاء على قيد الحياة الوحيد للخلايا الجذعية والسلف، بينما تموت الغالبية العظمى من العناصر الخلوية المتخصصة. مع مساعدة من هذه التقنيات في عام 1998 من قبل جيمس طومسون تم تخصيص خمسة خطوط خلدت من الخلايا الجذعية الجنينية من الكتلة الخلوية الداخلية من شخص الكيسة. في ذلك العام نفسه، وقد وضعت جون جيرهارت وسيلة لعزل خطوط ESC الخالدة من نفخة الجنسية للأجنة بشرية خمسة وأربعة أسابيع. بسبب خصائصها الفريدة ، في غضون عامين فقط ، بدأت بالفعل استخدام الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية للنسيج النهائي في ممارسة الطب التجديدي والعلاج الجيني.