نماذج تجريبية من هشاشة العظام

الغضروف هو نسيج عالي التخصص يحتوي على نوع واحد فقط من الخلايا (غضروفية) ، ويتميز بغياب الدم والأوعية اللمفاوية. يتم تنفيذ التغذية من الغضروف أساسا عن طريق امتصاص من السائل الزليلي. وينظم استقلاب الخلايا الغضروفية بواسطة عدد من العوامل القابلة للذوبان التي تنتج محليًا عن طريق الخلايا الغضروفية والأنسجة المحيطة بها. تعتمد وظيفة الخلايا الغضروفية أيضًا على تكوين الوسط خارج الخلوي (توتر الأكسجين ، تركيز أيون ، pH ، إلخ) ، تكوين VCM ، تفاعل الخلية والمصفوفة ، الإشارات الفيزيائية. المهمة الرئيسية للنمذجة التجريبية هي خلق الثقافات في البيئة خارج الخلية دون تغيير النمط الظاهري للخلايا الناضجة. وتتمثل المهمة الثانية في إنشاء ثقافات لدراسة الاستجابة المبكرة أو المتأخرة أو القصيرة أو الطويلة الأجل للخلايا الغضروفية للإشارات الكيميائية و / أو الفيزيائية. الدراسات في المختبر يوفر أيضا فرصة لدراسة سلوك خلية غضروفية في هشاشة العظام. المهمة الثالثة هي تطوير أنظمة علاجية مشتركة ، تسمح بدراسة تفاعلات الأنسجة المختلفة في المفصل. المهمة الرابعة هي إعداد الغرسات الغضروفية لعملية الزرع اللاحقة. وأخيرًا ، تتمثل المهمة الخامسة في دراسة عوامل النمو أو السيتوكينات أو العوامل العلاجية القادرة على تحفيز الإصلاح و / أو تثبيط ارتشاف الغضروف.

على مدى العقود الماضية ، تم إنشاء نماذج مختلفة من مزارع الخلايا الغضروفية المفصلية ، بما في ذلك الثقافات أحادية الطبقة ، والثقافات المعلقة ، وثقافات chondron ، explants ، cocultures ، ثقافات الخلية الخالدة. لكل ثقافة مزاياه وعيوبه ، وكل منها مناسب لدراسة جانب معين من عملية التمثيل الغذائي للخلية الغضروفية. وبالتالي ، فإن explants الغضروفية هي نموذج ممتاز لدراسة دوران عناصر المصفوفة ، والتي تتطلب مستقبلات سطح خلية حقيقية وتفاعلات الخلية الطبيعية ومصفوفة الخلية. في الوقت نفسه ، يوصى بدراسة الودائع في المصفوفة أو آليات لتنظيم التمثيل الغذائي خلية غضروفية على ثقافة الخلايا المعزولة. تعتبر الثقافة أحادية الطبقة منخفضة الكثافة ضرورية لدراسة عملية تمايز الخلايا. الثقافات المعلقة في مصفوفة طبيعية أو اصطناعية هي نموذج لتحليل الاستجابة التكيفية من غضروفية إلى الإجهاد الميكانيكي.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

الثقافات خلية غضروفية

عند اختيار أنسجة الغضروف للدراسات المختبرية ، يجب النظر في عدة نقاط مهمة. يختلف تكوين المصفوفة والنشاط الاستقلابي للغضروفية في المفاصل المختلفة ، ويعتمد الأخير أيضًا على عمق الخلية الغضروفية في الأنسجة. تم الحصول على هذه البيانات في العديد من التجارب التي تم فيها دراسة المجموعات الفرعية المعزولة من غضروفية من مناطق الغضروف من أعماق مختلفة. تم العثور على عدد من الاختلافات المورفولوجية والبيوكيميائية بين الخلايا الغضروفية المزروعة الموجودة في السطح والطبقات العميقة من الغضروف المفصلي. تخليق الخلايا السطحية مصفوفة ليفية بروتيوجليكانية نادرة ، مستنفدة ، بينما تنتج الخلايا الأعمق مصفوفة غنية بالفيبر والبروتيوغليكان. وعلاوة على ذلك ، فإن الخلايا السطحية تنتج بروتيوجليكان غير مجمعة نسبياً وحمض هيالوروني وكبريتات كيراتان أقل نسبياً من الخلايا الغضروفية الأكثر عمقاً. وهناك سمة أخرى هامة مهمة في عملية التمثيل الغذائي ل chondrocytes المعزولة من مناطق الغضروف في أعماق مختلفة هي الاستجابة للمنبه الخارجي. وفقا ل M. Aydelotte والمؤلفين المشاركين ، كانت chondrocytes الثور من المنطقة السطحية للغضروف أكثر حساسية ل IL-1 من خلايا المنطقة العميقة.

يعتمد سلوك الخلايا أيضًا على موقع النسيج. غضروفية غضروف الأذن والحواف، مأخوذة من نفس الحيوان التي تتفاعل بشكل مختلف لعوامل النمو مثل عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، وTGF بيتا. زاد FGF دمج thymidine ، proline و leucine في ثقافة chondrocyte من الأضلاع ، ولكن ليس الأذن. TGF-P زيادة إدماج الثيميدين إلى غضروفية غضروف الضلع والأذن، ولكن لم يكن لها تأثير على دمج ثيميدين إلى غضروفية والأذن البرولين. تختلف خلايا الغضروف التي يتم الحصول عليها من مناطق تحمل أكبر حمولة عن تلك الموجودة في المواقع ذات الحمل المنخفض على الغضروف. على سبيل المثال، غضروفية ناضجة من غضروف مفصل الركبة من المنطقة الوسطى من الأغنام مفصلي سطح عظام الساق العظام التي لا تغطيها الغضروف المفصلي، الذي يحمل أكبر حمولة في الجسم الحي، أصغر aggrecan توليفها، decorin ولكن أكبر من الخلايا من المجالات التي الغضروف المفصلي تغطيتها. يؤكد الباحثون أيضًا على أهمية استخدام الغضروف من مناطق المفصل المتشابهة عند فحص الوظيفة التركيبية للمفاصل.

كما يعتمد أيض الخلايا الغضروفية واستجابتها للعوامل التنظيمية بشكل كبير على عمر المتبرع ، وتطوير هيكله العظمي وحالة المفاصل التي تؤخذ منها الخلايا. في غضروفية الإنسان ، لوحظ انخفاض كبير مع عمر الاستجابة التكاثري. ويلاحظ أكبر انخفاض في الجهات المانحة الذين تتراوح أعمارهم بين 40-50 سنة وأكثر من 60 عاما. علاوة على ذلك ، فإن شدة الاستجابة التكاثري لعوامل النمو (مثل ، FGF و TGF-beta) تقل خلال الشيخوخة. بالإضافة إلى التغييرات الكمية في انتشار الخلايا الغضروفية ، هناك أيضا تغييرات نوعية. تستجيب الخلايا المانحة الشابة (10-20 سنة) بشكل أفضل لعامل النمو المشتق للصفيحات (PDGF) مقارنة بـ TGF-beta ، في حين يلاحظ العكس في الخلايا المانحة للبالغين. لشرح التغييرات التي تعتمد على العمر في الوظيفة التركيبية ل chondrocytes واستجابتها لتأثير عوامل النمو ، يتم استخدام عدة آليات. من بينها ، انخفاض في عدد والألفة من المستقبلات الخلوية السطحية ، وتغير في التوليف والنشاط الحيوي لعوامل النمو والسيتوكينات ، وتعديل إشارات ما بعد المستقبل.

كما أن الحالة المرضية للمفاصل تؤدي إلى تغيير شكل التشظير والنشاط الاستقلابي للغضروفية. لذلك ، حدد J. كوري والمؤلفين المشاركين (1996) ثلاثة سكانية فرعية من غضروفية في الغضروف مع هشاشة العظام. Chondrocytes من وسط الطبقة العليا والطبقة العليا من الغضاريف تشكل مجموعات وتكوين المزيد من بروتيوغليكان والكولاجين. TGF-beta وعامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) قادران على تحفيز تخليق البروتينات بواسطة الخلايا الغضروفية وتحييد تأثيرات IL-1 و TNF-a جزئيا. وتعاني الغضروف explants يعانون من هشاشة العظام، وغضروفية المعزولة من غضروف المرضى الذين يعانون من هشاشة العظام، أكثر حساسية لتحفيز TGF بيتا من غضروفية غضروف صحية. ترتبط هذه الاختلافات على الأرجح بالتغيرات النمطية في الخلايا الغضروفية في الطبقات العليا من الغضروف المفصلي.

يتم تحقيق عزل غضروفية الفردي من خلال العلاج المتسلسل مع الانزيمات المحللة للبروتين من ECM. بعد إطلاقها من ECM ، تكون الخلايا المعزولة مناسبة بشكل مثالي لدراسة تركيب مكونات مصفوفة de novo matrix . بعض المؤلفين يستخدمون فقط كلوستريديوم كولاجيناز ، وآخرون احتضان الغضروف مع التريبسين ، والبرونيز ، والدناز و / أو الهيالورونيداز. يعتمد عدد الخلايا المعزولة على الإنزيمات المستخدمة. وهكذا، عند معالجة واحدة من 1 غرام الأنسجة كولاجيناز يمكن الحصول 1،4T0 ⁶ غضروفية، بينما عند استخدام pronase، هيالورونيداز وكولاجيناز - 4،3-10 ⁶. عند المعالجة مع كولاجيناز ، تظل أغريكان ، والبروتينات ، و IL-6 ، و IL-8 في الثقافة الخلوية أكثر بكثير مما هي عليه في حالة العلاج المتسلسل مع مختلف الإنزيمات. هناك عدة تفسيرات لهذه الاختلافات بين ثقافتي الخلية:

• المستقبلات الخلوية التالفة أو الاكتئاب بفعل الإنزيمات، TGF بيتا يمنع تركيب الحمض النووي من البروتيوغليكان في غضروفية المعزولة حديثا (يوم 1)، في حين أن الحمض النووي والتوليف بروتيوغليكان من غضروفية مثقف في أحادي الطبقة (7 أيام) يحفزه TGF بيتا. ومع ذلك ، لإعادة عرض هذه المكونات الغشائية ، مطلوب فترة كافية قبل بدء التجربة.
• يمكن للبروتياز الخارجي أن يكسر تفاعل الخلايا والمصفوفة ، بوساطة integrins. تشجع عائلة إنتغرين ارتباط الخلايا الغضروفية بجزيئات VKM (Shakibaei M. Et al. ، 1997) ، ويمكن أن يؤثر هذا التمزق على تعبير جينات المصفوفة.
• يمكن للمخلفات من مكونات المصفوفة تنظيم الوظيفة التركيبية للغضروفية. تستطيع Integrins التعرف على منتجات التدهور في ECM ، وبالتالي تلعب دورًا مهمًا في إصلاح الأنسجة بعد التعرض للأنزيمات المحللة للبروتينات. أفاد ت. لارسون والمؤلفون المشاركون (1989) أن إضافة المواليد المؤيدين للأسماك السليمة أو المجزأة إلى ثقافة الخلية يحفز توليف البروتينات والبروتيوغليكان. ومع ذلك، مستويات عالية من حمض الهيالورونيك يؤدي إلى انخفاض كبير في إدراج التوليف بروتيوغليكان الكبريتات التي كتبها غضروفية غضروفية جنين الدجاج تنضج خلايا الخنازير والفئران غضروفية. وعلاوة على ذلك ، حمض الهيالورونيك هو مثبط لإطلاق بروتيوغليكان من الخلايا حتى في وجود IL-lb ، TNF-a ، FGF ، مما يشير إلى مقاومة أول نشاط بيولوجي لعوامل النمو والسيتوكينات. الآلية الدقيقة الكامنة وراء عمل حمض الهيالورونيك تبقى غير واضحة. من المعروف أن الخلايا الغضروفية تحتوي على مستقبل حمض الهيالورونيك المرتبط بشعيرات الأكتين من العصارة الخلوية. إن ربط حمض الهيالورونيك بمستقبلاته يحفز فسفرة البروتينات. وهكذا ، فإن هذه البيانات تدل على تشكيل وظيفة التمثيل الغذائي من غضروفية بواسطة جزيئات مجزأة أو الأم من البروتينات المصفوفة من خلال تنشيط خلايا مستقبلات الغشاء.
• يمكن أن يكون التحفيز السريع بواسطة إنزيمات تخليق البروتينات المصفوفة بواسطة غضروفية ناتج عن تغير في شكل الخلايا الغضروفية و / أو إعادة تنظيم الهيكل الخلوي.
• بعض السيتوكينات (على سبيل المثال IL-8) وعوامل النمو (على سبيل المثال ، IGF-1 ، TGF-P) ثابتة في ECM. المثال الأكثر شهرة هو الربط بين TGF-beta و decore ، مما يؤدي إلى انخفاض في قدرة السابق على تحفيز النمو الخلوي في خلايا المبيض في الهامستر الصيني. تشير البيانات التي يزداد محتواها من زخرفة الغضاريف مع تقدم العمر ، إلى انخفاض في التوافر الحيوي ل TGF-beta في الشيخوخة. يمكن تحرير عوامل النمو والسيتوكينات من مخلفات المصفوفة أثناء الاستزراع ثم تعديل وظيفة الغضروف.

[8], [9], [10], [11],

أحادي الطبقة ثقافة chondrocytes

يتميز النمط الظاهري المتباين من الخلايا الغضروفية في المقام الأول بتوليف الكولاجين من النوع الثاني والبروتيوجليكانات الخاصة بالنسيج ، بالإضافة إلى انخفاض مستوى النشاط الانقسامي. هناك أدلة على أنه مع الزراعة المطولة للخلايا في أحادي الطبقة ، وبعد عدة مقاطع متكررة من الخلايا ، تفقد الخلايا الغضروفية مخططاتها الكروية ، وتكتسب شكلاً طويلًا شبيهاً بالأرومات الليفية. مع هذا الليفية حؤول ظيفة الاصطناعية أيضا تعديل الخلايا، التي تتميز بانخفاض تدريجي في توليف الكولاجين II والتاسع والحادي عشر أنواع وتحسين توليف الكولاجين الأول والثالث وUtipov. يتم توليف بروتيوجليكانات صغيرة غير مجمعة بواسطة aggrecan وظيفية. Synthetzatepsin B و L منخفض للغاية في الخلايا المتمايزة ، ولكن في عملية فقدان التمايز يزيد. يتم التعبير عن كولاجيناز -1 في خلايا غضروفية متباينة ، مع زراعتها المطولة ، وتقلص التعبير عنها ، في حين يزداد إنتاج مثبطات الأنسجة في الميتالوبروتيز (TIMP).

تقوم الخلايا الغضروفية المتباينة بإعادة التعبير عن الكولاجين الخاص بالنمط الظاهري المتمايز عندما يتم نقلها من ثقافة أحادية الطبقة إلى واحدة معلقة. من المحتمل أن تكون عملية التمايز مرتبطة بشكل الخلايا. يستخدم هذه الخاصية بشكل منتظم من قبل الباحثين الذين يدرسون زراعة معيبة مع غضروفية ذاتية. يمكن مضاعفة عدد قليل من الخلايا التي تم الحصول عليها من مادة الخزعة في ثقافة أحادية الطبقة ثم وضعها مرة أخرى في مصفوفة ثلاثية الأبعاد قبل الزرع. يمكن تحفيز إعادة التعبير عن نمط ظاهري معين من قبل غضروفية غير مفهومة نقلها إلى ثقافة الاغاروز مع TGF-p ، وهو مركب ossein-hydroxyapatite وحامض الأسكوربيك.

استجابة لتأثير عوامل النمو والسيتوكينات ، يتم تعديل الخلايا الغضروفية خلال عملية التمايز. تختلف الاستجابة الخلوية للسيتوكينات وعوامل النمو بين غضروفية غير متمايزة ومتباينة. يقوم IL-1 بتحفيز تكاثر الخلايا الليفية ، في حين يتم منع نمو خلايا الغضروف غير المتمايزة بواسطة IL-1. يتم تحفيز توليف الحمض النووي عن طريق IGF-1 في الخلايا الغضروفية الممدودة ، ولكن غير المسوية. في الخلايا الغضروفية المتباينة ، تكون التأثيرات المنبهة لـ IL-1β و TNF-α على منتجات procollagenase أكثر وضوحًا من تلك الموجودة في غير المتمايزة.

زراعة غضروفية

زراعة الخلايا الغضروفية في المعلق في وسط سائل أو في مصفوفة ثلاثية الأبعاد طبيعية أو اصطناعية تستقر النمط الظاهري من خلية غضروفية. تحتفظ الخلايا بشكلها الكروي ، وتصنع البروتينات الخاصة بالنسيج. ينصح عادة ثقافة خلية غضروفية مرجحة لدراسة تشكيل مصفوفة جديدة للخلية. وتستخدم الثقافات في الخلايا الغضروفية في البوليمرات الاصطناعية أو ماصة طبيعية لزراعة الخلايا في عيوب الغضاريف لتحفيز تجديد الأنسجة الغضروفية في المفصل. يجب أن تستوفي البيئة الاصطناعية أو الطبيعية للخلايا المزروعة عددًا من المتطلبات:

• يجب أن تحتوي المزروعات على بنية مسامية للالتصاق ونمو الخلايا ،
• لا ينبغي أن يسبب البوليمر نفسه أو منتجات تحلله التهابًا أو تفاعلات سامة خلال عملية زرع الكائن الحي ،
• يجب أن يكون ناقل الحامل قادرًا على ربط الغضروف المجاور أو العظم تحت الغضروف ،
• يجب أن تكون المصفوفة طبيعية أو اصطناعية قادرة على الامتصاص ، ويجب موازنة تدهورها عن طريق تجديد الأنسجة ،
• لتسهيل إصلاح الغضروف ، يجب أن تساعد البنية الكيميائية ومصفوفة البنية للمصفوفة على الحفاظ على النمط الظاهري الخلوي المدرج في الخلايا الغضروفية وتوليف البروتينات الخاصة بالنسيج ،
• خلال زرع في الجسم الحي ، فمن الضروري دراسة الخواص الميكانيكية للمصفوفة الاصطناعية أو الطبيعية.

[12], [13], [14], [15], [16]

تعليق غضروفية في الطور السائل

مرفق الخلية إلى الأوعية البلاستيكية، الذي يستنبت من غضروفية يمكن منع جدرانها مغطاة السليلوز حل الميثيل، الاغاروز، هيدروجيل (بولي-2-hydroxyethylmethacrylate) أو مزيج من الكولاجين الاغاروز. في ظل هذه الظروف ، تشكل الخلايا الغضروفية التكتلات وتجمع بشكل رئيسي الكولاجين aggrecan والنسيج محددة (أنواع II ، IX ، XI). عادة ، يتم العثور على نوعين من الخلايا. تحتفظ الخلايا الموجودة في المركز بشكل كروي محاطًا بآلية ECM متطورة ، والتي تؤكدها الدراسات الكيميائية النسيجية والهيكلية. على chondrocytes المحيطية لها ملامح القرصية ، وتحيط بها ECM نادرة. لا يعرف سوى القليل عن الخصائص الوظيفية لهذه الخلايا.

من الممكن زراعة غضروفية على الحافظات الصغيرة مدعومة في نظام التعليق ؛ يتم استخدام حبات ديكستران (cytodex) ، حبات ديكستران المغلفة الكولاجين (cytodex III) ، microspheres غير الفراغ من نوع الكولاجين الأول (الكولاجين) كما microcarriers. تحت ظروف الثقافة هذه ، تلتصق الخلايا الغضروفية بسطح المصغرة ، وتحتفظ بشكلها الكروي ، وتنتج مادة تشبه المصفوفة. وعلاوة على ذلك ، فإن استخدام الكولاجين يعزز انتشار الخلايا الغضروفية وإعادة تمثيل النمط الظاهري الطبيعي. لذلك ، يمكن استخدام زراعة الخلايا الغضروفية على المجهرية للكولاجين لاستعادة النمط الظاهري للخلية قبل الزرع.

وهناك طريقة أخرى لزراعة تعليق الخلايا الغضروفية في وسط سائل وهي زراعةها على شكل حبات كثيفة تتكون من خلايا (0.5-1 * 10 ^b ) يتم الحصول عليها بواسطة الطرد المركزي. هذه الخلايا الغضروفية قادرة على إنتاج مصفوفة تحتوي على عدد كبير من بروتيوغليكان ، كولاجين من النوع الثاني ، ولكن ليس من النوع الأول الكولاجين ، والذي يتم تأكيده بواسطة طرق الأنسجة ، المناعية والكمية.

تعليق الخلايا الغضروفية في ECM طبيعي

يمكن استنبات غضروفية في التعليق في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (أجار لينة ، agarose ، هلام الكولاجين أو الإسفنج ، وحامض الهيالورونيك ، الغراء الفيبرين ، حبات ألجينات).

غضروفية agarose مثقف الاحتفاظ النمط الظاهري العادي وتوليف الكولاجين من النوع الثاني والمجاميع الجديدة الكلي محددة الأنسجة. عند استزراعها في agarose ، يتم إطلاق بروتيوجليكانز الخلوي في الوسط لمدة 50 يوما. للمقارنة - في الثقافة أحادية الطبقة ، يتم ملء مرحلة الخلية مع الجليكوسامينوجليكان بالفعل في أول 5-6 أيام من الزراعة ؛ عندما يزرع في الوسط بعد تكثيف تركيب وإطلاق الجلايكوسامينوجليكان ، يحدث الانخفاض في الوقت المستغرق في الجليكوسامينوجليكان في أول 8-10 أيام. ومع ذلك ، فإن سلوك chondrocytes خلال زراعتها في agarose يختلف عن ذلك في ظروف الجسم الحي. في agarose ، يحتوي عدد كبير من المجاميع Aggregan المركب على جزيئات أصغر وأصغر من في الجسم الحي. TGF-P يحفز توليف بروتيوغليكان في يزدرع ، لكنه يقلل من توليف aggrecan في agarose.

الجينات هو عديد السكاريد خطي مشتق من الأعشاب البحرية البني. في وجود الكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مثل ^أيونات Ca ^{+ +} ، يصبح هذا البوليمر جلًا. كل خلية غضروفية وقعوا في الجينات، وتحيط بها مصفوفة من السكريات سالبة الشحنة، المسام منها قابلة للمقارنة مع تلك التي غضروف زجاجي. المصفوفة التي تتشكل غضروفية في حبات الجينات، ويتألف من جزأين - طبقة رقيقة من مصفوفة الخلايا المرتبطة الموافق المصفوفات المحيطة بالخلايا والإقليمية الغضروف المفصلي والمزيد من المصفوفة بعد تعادل مشتركة الأقاليم في أنسجة الأم. في اليوم ال30 للثقافة والحجم النسبي والمطلق محتلة من قبل الخلايا، ولكل من الإدارتين في حبة الجينات غير متطابقة تماما تقريبا لتلك التي الغضروف الأصلي. منذ ما يقرب من 30 يوما غضروفية تحتفظ شكلها الكروي وتنتج aggrecan، والخصائص الهيدروديناميكية التي هي مماثلة لتلك الجزيئات aggrecan في مصفوفة مفصلي الغضروف والكولاجين جزيء الثاني والتاسع والحادي عشر أنواع. في نفس الوقت، مثل الثقافات الأخرى، ومعلقات، والخرز الجينات الموجودة على سطح الخلايا بالارض موجودة التي تولد كمية صغيرة من النوع الأول الكولاجين الجزيئات، الذي صدر مباشرة في البيئة وعدم إدراجها في VCR. في الخرز الجينات ، لوحظ انتشار معتدل من غضروفية. بعد 8 أشهر من زراعة في هلام الجينات غضروفية ناضجة لا تفقد النشاط الأيضي ويستمر لتجميع الأنسجة محددة نوع الكولاجين II وaggrecan.

بحث تاناكا و coauthors (1984) في خصائص انتشار الجزيئات الطبيعية المختلفة في الالجينات ووجدوا أن الجزيئات الأكبر من 70 كيلو دالتون لا تنتشر عبر الجينات. وبالتالي ، فإن زراعة الخلايا في الجينات هي مناسبة لدراسة تنظيم التخليق الحيوي والتنظيم ECM. توافر الخلايا المزروعة في الجينات يسمح للمرء بالتحقق من تأثير العوامل التنظيمية الببتيد والعوامل الدوائية على مستويات النسخ ، ما بعد الناسخ والترجمة.

يتم استزراع الخلايا الغضروفية أيضًا في مصفوفة من ألياف الكولاجين الأول والثاني. S. Nehrer وآخرون (1997) مقارنة العملية في الكلاب خلية غضروفية بروتيوغليكان بصرف النظر مصفوفة الكولاجين البوليمر تحتوي على الكولاجين من أنواع مختلفة. وجدوا اختلافات مهمة في مورفولوجية وظيفة التخليق الحيوي من غضروفية مستزرعة في المصفوفات الكولاجينية التي تحتوي على أنواع الكولاجين الأول والثاني. الخلايا في مصفوفة الكولاجين من النوع الثاني ملفوفة شكلها الكروي ، بينما في النوع الأول من الكولاجين ، كان لديهم مورفولوجيا تشبه الأرومات الليفية. علاوة على ذلك ، في مصفوفة الكولاجين من النوع الثاني ، أنتجت الخلايا الغضروفية المزيد من جليكوسامينوجليكان. قارن J. Van Susante et al (1995) خصائص الخلايا الغضروفية المستزرعة في الجينات والكولاجين (النوع الأول) هلام. وجد الباحثون زيادة كبيرة في عدد الخلايا في هلام الكولاجين ، ولكن من اليوم السادس من الزراعة فقدت الخلايا النمط الظاهري المميز ، وتحولت إلى خلايا تشبه الأرومة الليفية. في هلام الجينات ، لوحظ انخفاض في عدد الخلايا ، ولكن الخلايا الغضروفية احتفظت بنمطها الظاهري الطبيعي. كانت كمية البروتيوغليكان جل الكولاجين لكل خلية أعلى بكثير مما كانت عليه في الجينات، ولكن لوحظ انخفاض في تركيب عناصر هلام مصفوفة ابتداء من اليوم 6TH زراعة، في حين واصلت في تركيب الجينات في النمو.

إن مصفوفة الفيبرين الصلبة ثلاثية الأبعاد هي مادة طبيعية تدعم الخلايا الغضروفية التي تزن فيها في نمط ظاهري متمايز. كما يمكن استخدام مصفوفة الفيبرين ثلاثية الأبعاد كحامل لزرع الخلايا الغضروفية. مزايا الفيبرين هي عدم وجود السمية الخلوية ، والقدرة على ملء الفراغ ، والقدرة لاصقة. من خلال الدراسات النسيجية والكيميائية الحيوية ، التصوير الإشعاعي الذاتي ، والمجهر الإلكتروني ، تم العثور على الخلايا الغضروفية في هلام الفيبرين للحفاظ على مورفولوجيتها ، وتتكاثر وتنتج مصفوفة حتى بعد 2 أسابيع من الثقافة. ومع ذلك ، أفاد G. Homminga والمؤلفين المشاركين (1993) أنه بعد 3 أيام من الزراعة ، يبدأ تفكك الفبرين ، يتطور التفرقة في الخلايا الغضروفية.

تعليق غضروفية في اصطناعي (صناعي) ECM

يمكن الحصول على غضاريف الغضروف لجراحة ترميمية أو تقويم العظام عن طريق زراعة غضروفية معزولة في المختبر في مصفوفة متوافقة حيويا تركيبيا.

تتكاثر خلايا غضروفية حامض بوليغليكوليك مثقف وتحافظ على الشكل الطبيعي والشكل الظاهري خلال 8 أسابيع. يتكون مجمع حامض الكوندريسيت-بوليجليكوليك من الخلايا ، الجلايكوزامينوجليكان ، الكولاجين ، وله كبسولة خارجية من الكولاجين. ومع ذلك ، في هذه يزرع هناك نوعان من جزيئات الكولاجين - الأول والثاني. يزرع من dedifferentiated من قبل سلسلة من الممرات من chondrocytes لديها عدد أكبر من glycosaminoglycans و collagens من في يزرع من chondrocytes غير متمايزة في المقام الأول.

قيم L. Freed and co-authors (1 993b) سلوك ثقافات خلية غضروفية بشرية وثور في حمض بوليغليكوليك ليفي (HPHC) وفي حمض polylactic (PPLC). بعد 6-8 أسابيع من زراعة غضروفية الثور في HSVG أو PPLC ، لاحظ المؤلفان تكاثر الخلايا وتجديد مصفوفة الغضاريف. في HSBC ، كانت الخلايا الغضروفية كروية ، وتقع في ثغرة تحيط بها مصفوفة غضروفية. بعد 8 أسابيع من الاستزراع في المختبر ، احتوى النسيج المجدد على 50٪ من المادة الجافة (4٪ من كتلة الخلية ، 15٪ من الجليكوزامينوجليكان ، و 31٪ من الكولاجين). في الخلايا PPLK كانت على شكل المغزل ، وكمية صغيرة من الجليكوسامينوجليكان والكولاجين. في HSBC ، كان نمو الخلايا أكثر كثافة مرتين من PTCA. في ظل ظروف في الجسم الحي غضروفية تزرع في EQAP وPPLC ل1 -6 أشهر عملنا من الأنسجة مماثلة تشريحيا للغضروف. غرسات تحتوي على جليكوسامينوجليكان ، نوع الأول ونوع كولاجين.

تم استزراع غضروفية الثور الجنينية في بولي إيثيلين مسامي عالي الكثافة ومحبب للماء. بعد 7 أيام من الحضانة في كل من الركائز ، احتفظت الخلايا بشكل كروي ، يحتوي بشكل أساسي على الكولاجين من النوع الثاني. بعد 21 يومًا من الزراعة ، اتضح أن مصفوفة الماء تحتوي على المزيد من الكولاجين من النوع الثاني من المصفوفة الكارهة للماء.

ويمكن أيضا الحصول على نسيج غضروف عن طريق زراعة في أحادي الطبقة على مرشحات Millicell-CM. قبل طلاء المرشحات مع الكولاجين ضروري لتعلق chondroits. الفحص النسيجي للثقافة يدل على تراكم الخلايا الغضروفية في ECM التي تحتوي على بروتيوغليكان والكولاجين من النوع الثاني. لم يتم الكشف عن نوع الكولاجين الأول في مثل هذه الثقافة. الخلايا الغضروفية في الأنسجة الغضروفية الناتجة لها شكل كروي ، ولكن على سطح النسيج يتم تسطيحها إلى حدٍ ما. زادت سماكة الأنسجة المشكلة حديثًا بمرور الوقت واعتمدت على الكثافة الأولية للأحادي الطبقة للخلايا. في ظل ظروف الثقافة المثلى ، وصل سمك النسيج الغضروفي إلى 110 ميكرومتر ، كما أن تنظيم خلاياها وكولاجينها في السطح والطبقات العميقة يشبه غضروف المفصلي. يحتوي VKM على ما يقرب من 3 مرات من الكولاجين والبروتيوغليكان. بعد أسبوعين من الزراعة ، لوحظ تراكم المصفوفة ، مما مكن من استخراج النسيج من الفلتر واستخدامه للزراعة.

درس سيمز وآخرون (1996) زراعة الخلايا الغضروفية في مصفوفة بوليمر مغلفة بأكسيد البولي إيثيلين تسمح بنقل عدد كبير من الخلايا عن طريق الحقن. بعد ستة أسابيع من الحقن في النسيج تحت الجلد من الفئران athymic ، تم تشكيل غضروف جديد ، والتي تتميز شكليا من قبل opalescence الأبيض مماثلة للغضروف hyaline. أشارت البيانات من الدراسات النسيجية والكيميائية الحيوية إلى وجود خلايا غضروفية ناشئة نشطة ، والتي تنتج ECM.

Explantation

يتم استخدام فحص الأنسجة الغضروفية لدراسة عمليات ana- وهدم في ذلك ، التوازن ، ارتشاف وإصلاح. Chondrocytes في explants الأنسجة الغضروفية دعم النمط الظاهري وتكوين ECM ، على غرار تلك الموجودة في الغضروف المفصلي في الجسم الحي. بعد 5 أيام من الزراعة في وجود مصل ، يتم تحقيق مستوى ثابت من التوليف والتدهور الطبيعي. ارتشاف يمكن تسريع زراعة الأنسجة وفي الثقافة الرئيسية مع إضافة المصل باستخدام عدد من وكلاء، على سبيل المثال، IL-IB، TNF-لذلك، bakterialnyhlipopolisaharidov، مشتقات حمض الريتينويك أو الجذور الأكسجين النشطة. لدراسة إصلاح الغضروف ، يتم إحداث الضرر من قبل وسطاء قابل للذوبان للالتهاب (H ₂ O ₂ ، IL-1 ، TNF-a) أو تمزق المادي.

طريقة الثقافات النمطية هي نموذج لدراسة الآثار المختبرية للعوامل الخارجية المعزولة على غضروفية والمصفوفة المحيطة بها. في الجسم الحي ، نادرا ما تقع غضروفية في ECM ولا تتصل ببعضها البعض. تحتفظ ثقافة الغضروف المفصلي المستعرض بهذه التنظيم البنيوي ، بالإضافة إلى التفاعلات الخاصة بين الخلايا الغضروفية والبيئات المحيطة بها خارج الخلية. كما يستخدم هذا النموذج لدراسة تأثير الإجهاد الميكانيكي ، والعوامل الدوائية ، وعوامل النمو ، والسيتوكينات ، والهرمونات على عملية التمثيل الغذائي للغضروف.

وهناك ميزة أخرى لاكتشاف الأنسجة الغضروفية هي عدم وجود تلف في خلية الغضروف عن طريق إنزيمات بروتينية أو عامل ميكانيكي ، وهو أمر لا مفر منه عندما يتم عزل الخلايا. يتم حماية المستقبلات والبروتينات الغشائية الأخرى والبروتينات السكرية من العوامل الضارة.

[17], [18], [19], [20], [21]

ثقافة chondrons

Chondron عبارة عن وحدة هيكلية ووظيفية وأيضية من الغضروف المفصلي ، تتكون من خلية غضروفية ، ومصفوفة خلوية لها وكبسولة خيوط مدمجة ، وهي مسؤولة عن الاستتباب المصفوفي. يتم استخراج chondrons ميكانيكيا من الغضروف والتي تم جمعها من قبل العديد من التجانس متواضع السرعة المنخفضة. معزولة عن مناطق أعماق مختلفة الغضروف hondrony يمكن تقسيمها إلى أربع فئات: hondron احد، hondrony التوأم، متعددة (ثلاث أو أكثر) hondrony ترتيب خطيا (العمود hondronov) hondronov الازدحام.

يتم العثور على عادة chondrons واحدة في الطبقات الوسطى من الغضروف سليمة ، إقران - على حدود الطبقات المتوسطة والعميقة ، تحديد موقع chondrons متعددة بشكل خطير للطبقات العميقة من الغضروف سليمة. وأخيراً ، تتكون مجموعات chondrons من مجموعات منظمة عشوائياً من chondrons مفردة ومُزدوجة التي تحتفظ بالحالة المجمعة بعد التجانس. تراكمات chondrons هي شظايا كبيرة من الغضروف ، وعادة ما تحتوي على العديد من chondrons و fibrils الكولاجين شعاعي الموجود ، أي ، خاصية مميزة نموذجية للطبقات العميقة من المصفوفة. تجمد الشرنات في agarose شفافة ، والذي يسمح لدراسة هيكلها ، تكوين الجزيئي والنشاط الأيضي. يعتبر نظام الأجاروز الغضروفي بمثابة نموذج مصغر للغضروف ، والذي يختلف عن نظام غضروفي التقليدي - الاغاروز في أن البيئة المكروية الطبيعية يتم الحفاظ عليها ، وليس هناك حاجة لأداء تركيبها وتجميعها. ثقافة chondrons هو نموذج لدراسة تفاعلات الخلايا والمصفوفة في الغضروف المفصلي في الظروف الطبيعية والمرضية.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

ثقافة chondrocytes الخالد

لإنشاء خطوط خلية دائمة ، يتم استخدام الحمض النووي المؤتلف أو فيروسات تحتوي على oncogen التي يمكن أن تجعل الخلية "خالدة". الخلايا الغضروفية الخالدة لديها القدرة على الانتشار اللانهائي ، والحفاظ على النمط الظاهري الثابت. F. مالئين-Gerin وآخرون (1995) أظهرت أن الجين الورمي هو الانتشار الناجم SV40T من غضروفية الماوس التي بالتالي الاستمرار في التعبير عن ستابلي الكولاجين II والتاسع والحادي عشر أنواعها، وكذلك البروتين ملزم المشترك وaggrecan. ومع ذلك ، فإن مثل هذا الخط الخلوي يكتسب القدرة على توليف النوع الأول من الكولاجين عند تربيته في مزرعة أحادية الطبقة أو في هلام agarose.

وصف دبليو هورتون والمؤلفون المشاركون (1988) خطًا للخلايا الخالدة بمستوى منخفض من تعبير الكولاجين من النوع II مرنا. تم الحصول على هذه الخلايا عن طريق تحويلها باستخدام فيروس ارتجاعي يحتوي على I-myc و y-ra-oncogenes. هذا النوع من الخلايا هو نموذج فريد لدراسة تفاعلات المصفوفة المفصلية في غياب الكولاجين من النوع الثاني ، بالإضافة إلى تنظيم تركيب الكولاجين من النوع الثاني.

إن ثقافة الغضروفيات ذات الجينات الطافرة أو المحذوفة هي نموذج ملائم لدراسة وظيفتها الفسيولوجية. هذا النموذج مناسب بشكل خاص لدراسة دور جزيئات محددة في تنظيم مصفوفة غضروفية أو دراسة تأثيرات العوامل التنظيمية المختلفة على عملية التمثيل الغذائي للغضروف. Chondrocytes مع جينوم محذوف من نوع IX كولاجين يخلق ألياف الكولاجين بشكل أوسع من الطبيعي ، مشيرا إلى أن نوع الكولاجين IX ينظم قطر الألياف. كما لوحظ في الفصل الأول ، تم في الآونة الأخيرة الكشف عن طفرة في كولاي كولاي من النوع الثاني المشفّر في العائلات المصابة بالتهاب المفاصل العظمي الأولي. لدراسة تأثير متحولة نوع الكولاجين II في المصفوفة المفصل R. Dharmrvaram وآخرون (1997) يؤديها ترنسفكأيشن ( "تلوث" حمض نووي أجنبي) معيب COL ₂ AI (أرجينين في موقف 519 يتم استبدال السيستين) في غضروفية الجنين البشري في المختبر.

نظام من cocultures. في المفصل ، يتفاعل الغضروف مع خلايا من الأنواع الأخرى الموجودة في الغشاء الزليلي ، السائل الزليلي ، الأربطة ، العظم تحت الغضروف. يمكن أن تتأثر عملية التمثيل الغذائي للغضروفية بعوامل متعددة قابلة للذوبان تم توليفها بواسطة هذه الخلايا. لذا ، يتم تدمير الغضروف المفصلي بالتهاب المفاصل بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين والجذور الحرة ، التي تنتجها الخلايا الزليليّة. لذلك ، تم تطوير نماذج لدراسة التفاعلات المعقدة بين الغضروف والأنسجة المحيطة ، والتي تُعرف باسم "زراعة الأشجار".

كانت S. لاكومب-Gleise وآخرون (1995) غضروفية أرنب مثقف وبانيات في النظام coculture (كوستار)، الذي تم فصل الخلايا غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها (0.4 ميكرون) يسمح للالتبادل بين أنواع الخلايا اثنين من دون أي اتصال مباشر. أثبتت هذه الدراسة قدرة بانيات العظم لتحفيز نمو الخلايا الغضروفية من خلال وسطاء قابل للذوبان.

AM قام مالفاي و المؤلفان المشاركان (1994) بالتحقيق في العلاقة بين حيدات الدم المحيط و الخلايا الغضروفية. هذا النموذج مناسب لدراسة العمليات بوساطة السيتوكينات ، في التهابات المفاصل الالتهابية (التهاب المفاصل الروماتويدي ، التهاب الفقار المصلي ، الخ). فصل معدو النموذج الخلايا عن طريق غشاء مرتبط بالبروتين مع قطر مسامي 0.4 ميكرومتر. ووجدت الدراسة أن حيدات حفز lipopolysaccharide في عادمة iFNO IL-1-لذلك، الذي يثبط تخليق غضروفية aggrecan وساهمت في تدهور المجاميع aggrecan تصنيعه بالفعل.

K. تادا وآخرون (1994) خلق نموذج coculture التي وضعت الخلايا البطانية في الكولاجين (I-نوع) جل في الغرفة الداخلية من غرفة الخارجية فصلها عن ذلك من قبل غضروفية وضعت في التصفية مع حجم المسام من 0.4 ميكرون. في حالة العزلة الكاملة من الغرفة الخارجية ، شكلت الخلايا البطانية الإنسان أنابيب في هلام الكولاجين في وجود EGF أو TGF-a. مع الزراعة المتزامنة لكلا النوعين من الخلايا TGF ، تم تثبيط التكوين المعتمد للأنابيب بواسطة الخلايا البطانية. تم القضاء على تثبيط خلية غضروفية من هذه العملية جزئيا عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة TGF-beta. يمكن الافتراض أن TGF-beta الذي تنتجه الخلايا الغضروفية يؤدي إلى انخفاض الأوعية الدموية للغضروف نفسه.

قام غروت وشركاؤه (1994) في وقت واحد بزراعة غضروفية من مناطق تضخم وتكاثرية في عظم فأر يبلغ من العمر 16 يومًا يحتوي على قطع من نسيج الدماغ. بعد 4 أيام من الثقافة ، لوحظت تباين في تحويل الخلايا الغضروفية إلى بانيات العظم وبداية تكوين العظم. بعد 11 يومًا من الزراعة ، تم استبدال جزء من الغضروف بنسيج عظمي وتمت مصفوفة العظم جزئياً. بعض neuropeptides والنواقل العصبية التي تنتجها أنسجة المخ ، تؤثر على عملية الأيض من بانيات العظم أو لديها مستقبلات عليها. من بينها ، يمكن عزل norepinephrine ، الببتيد الأمعاء فعال الأوعية ، الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين ، والمحتوى P و somatostatin. يمكن أن تنتج قطع من نسيج الدماغ ، مع الخلايا الغضروفية ، بعضًا من هذه العوامل ، والتي يمكن أن تحفز عملية التحول عبر الخلايا الغضروفية إلى بانيات العظم.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

تأثير العوامل الخارجية على ثقافة الغضروفية

تأثير التوتر الأوكسجين على عملية التمثيل الغذائي للغضروفية

في معظم الحالات ، تنمو ثقافات خلية غضروفية في ظروف توتر الأوكسجين في الغلاف الجوي. ومع ذلك ، فمن المعروف جيدا أن الخلايا الغضروفية في الجسم الحي توجد تحت ظروف نقص الأكسجين وتوتر الأوكسجين يختلف باختلاف الظروف المرضية. خلال عملية النضج ، لوحظت تغييرات كبيرة في إمدادات الدم من المشاش. بما أن الأوعية الدموية تختلف في مناطق مختلفة من لوحة النمو ، فإن توتر الأكسجين فيها يختلف أيضًا. أثبتت برايتون و ر. هبينتستال (1971) أنه في صفيحة الساق في الأرانب ، يكون توتر الأوكسجين في المنطقة الضخامية أقل مما هو عليه في الغضروف المحيط. وقد أظهرت قياسات بعض العوامل الأيضية أن الخلايا الغضروفية قادرة على الاستجابة بسرعة للتغيرات المحلية في تركيز الأكسجين. أولا وقبل كل شيء ، مع انخفاض التوتر الأكسجين ، انخفاض استهلاكه من chondrocytes. مع انخفاض التوتر في الأوكسجين من 21 إلى 0.04 ٪ ، وزيادة استخدام الجلوكوز ، وزيادة نشاط انزيم الجليكوليز وتصنيع حمض اللاكتيك. حتى مع وجود توتر منخفض في الأكسجين ، تبقى الكمية المطلقة من ATP و ADP و AMP ثابتة. تشير هذه البيانات إلى اتجاه التمثيل الغذائي للخلية الغضروفية من أجل زيادة الحفاظ على الطاقة. ومع ذلك ، فإن النشاط التخليقي ، وبالتالي عمليات الجبر ، يتغير في ظروف نقص الأكسجين.

يؤثر توتر الأكسجين العالي أيضًا على استقلاب الخلايا الغضروفية ، مما يؤدي إلى انخفاض في تخليق البروتينات والدنا ، وتآكل مصفوفة الغضروف. هذه الآثار ، كقاعدة عامة ، يرافقها إنتاج جذور الأكسجين الحرة.

تأثير تركيز الأيونات والضغط التناضحي للبيئة على وظيفة غضروفية

في الغضروف الأصلي ، يختلف تركيز الأيونات بشكل كبير عن مثيله في الأنسجة الأخرى: فمحتوى الصوديوم في الوسط خارج الخلوي هو 250-350 مللي مولار ، وتكون أوسمولياريته 350-450 موسمول. عندما عزل غضروفية من VCR وتفرخ لهم في وسائل الاعلام القياسية (DMEM (متوسط الأساسية الحد الأدنى Dulbecco و- الحد الأدنى المتوسطة الأساسية Dulbecco و) الأسمولية - 250-280،7 الميلي أسمول) التغييرات المحيطة بحدة بيئة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تركيز الكالسيوم والبوتاسيوم في الوسائط القياسية أقل بكثير من الأنسجة الأصلية ، وتركيز الأنيونات أعلى بكثير.

مضيفا المتوسطة السكروز يؤدي إلى زيادة الأسمولية ويؤدي الى زيادة عابرة في تركيز الخلايا H ⁺ والأيونات الكالسيوم في العصارة الخلوية. هذه التغيرات داخل الخلايا يمكن أن تؤثر على عمليات تمايز الخلايا الغضروفية ونشاطها الأيضي. وجد J. Urban et al (1993) أن دمج ³⁵ -كبريتات و ³ H-proline مع غضروفية معزولة محتضنة في وسط DMEM القياسي لمدة 2-4 ساعات كان 10٪ فقط من ذلك في الأنسجة الأصلية. بلغت ذروتها كثافة تركيب عندما الأسمولية من المتوسط خارج الخلية من 350-400 الميلي أسمول في غضروفية المعزولة حديثا والغضروف explants في. علاوة على ذلك ، ازداد حجم الخلية الحمراء بنسبة 30-40 ٪ بعد وضع الخلايا المعزولة في وسط DMEM القياسي من الأسمولية المذكورة. ومع ذلك ، في زراعة chondrocytes تحت osmolarity nonphysiological لمدة 12-16 ساعة ، تتكيف الخلايا لظروف جديدة ، مما يقلل من كثافة التخليق الحيوي بما يتناسب مع osmolarity من خارج الخلية.

P. بورجيتي وآخرون (1995) التحقيق في تأثير الأسمولية من المتوسط خارج الخلية على النمو والتشكل، والتركيب الحيوي من غضروفية الخنازير. أظهر المؤلفون خصائص بيوكيميائية ومورفولوجية مشابهة لظواهر غضروفية مستزرعة في أوساط ذات أوسمولاري من 0.28 و 0.38 موسمول. عندما لوحظ 0.48 الميلي أسمول الأسمولية من المتوسط خلال 4-6 ساعات الأولى من ثقافة انخفاض في تكاثر الخلايا وتخليق البروتين، ولكن في وقت لاحق وقعت استعادة هذه المعايير التي وصلت في نهاية المطاف القيم السيطرة. عندما زراعة غضروفية في المتوسطة مع خلايا الأسمولية 0.58 الميلي أسمول تفقد قدرتها على دعم عمليات التكاثري كثافة الفسيولوجية وبعد 6 أيام من خفض عدد غضروفية بشكل كبير. مع الأسمولية للوسط ، 0.58 mosmol ، لوحظ تثبيط عميق لتخليق البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، عند المثقف في وسائل الإعلام مع الأسمولية تحتفظ الميلي أسمول 0،28-0،38 غضروفية النمط الظاهري الفسيولوجية في الأسمولية أعلى (الميلي أسمول 0،48-0،58) تغييرات كبيرة في شكل الخلية، كما تتجلى فقدان مميزة النمط الظاهري غضروفية تحويل في الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية ، وكذلك فقدان الخلايا ، والقدرة على تجميع بروتيوغليكان المصفوفة. نتائج هذه الدراسة تشير إلى قدرة الخلايا الغضروفية على الاستجابة لتذبذب الأسمولية المحدود في البيئة خارج الخلية.

يمكن أن يؤثر التغير في تركيز أيونات أخرى أيضًا على عمليات التخليق الحيوي في الخلايا الغضروفية. وبالتالي ، فإن درجة إدراج ³⁵ S (الكبريتات) تزيد بمقدار النصف مع زيادة في تركيز أيونات البوتاسيوم من 5 ملمول (التركيز في وسط DM DM القياسي) إلى 10 ملمول (التركيز في VKM في الجسم الحي). ساهم تركيز الكالسيوم أقل من 0.5 مليمول في إنتاج الكولاجين بواسطة غضروفية الثور الناضجة ، في حين أن تركيز 1-2 مليمول (المقابل للتركيز في وسط DM DM القياسي) تسبب في انخفاض كبير في تخليق الكولاجين. لوحظ زيادة معتدلة في التخليق الحيوي عند مستويات عالية من الكالسيوم (2-10 مليمول). تشترك الكاتيونات المختلفة في تثبيت غضروفية إلى بروتينات VKM. وهكذا ، فإن أيونات المغنسيوم والمنغنيز توفر التعلق بالفيبرونيكتين والكولاجين من النوع الثاني ، في حين لا تشارك أيونات الكالسيوم في تعلق الخلايا الغضروفية بالبروتينات. وهكذا ، فإن نتائج الدراسات الموضحة تشير إلى تأثير التغيرات في أيونات خارج الخلية من البوتاسيوم ، الصوديوم ، الكالسيوم و osmolarity للوسط على وظيفة التخليق الحيوي للخلايا الغضروفية المحتضنة في الوسائط القياسية.

تأثير الإجهاد الميكانيكي على استقلاب غضروفية

تجميد المفصل يسبب ضمور عكسي للغضروف ، مما يدل على الحاجة إلى محفزات ميكانيكية للمسار الطبيعي لعمليات التمثيل الغذائي في ECM. في معظم الحالات ، توجد نماذج استزراع الخلايا المستخدمة في ظروف الضغط الجوي العادي. أظهر م. رايت وشركاؤه (1996) أن البيئة الميكانيكية تؤثر على استقلاب غضروفية ، تعتمد استجابة الخلايا على شدة وتكرار حمل الضغط. أظهرت التجارب التي أجريت على عمليات استكشاف الغضاريف المفصلية السليمة في المختبر انخفاضا في تخليق البروتينات والبروتيوغليكان تحت تأثير الحمل الساكن ، بينما يحفز التحميل الديناميكي هذه العمليات. الآليات الدقيقة لتحقيق تأثير الضغط الميكانيكي على الغضروف معقدة وقد تكون ذات صلة بتشوه الخلية ، الضغط الهيدروستاتي ، الضغط التناضحي ، الإمكانات الكهربية والمستقبلات الخلوية السطحية لجزيئات المصفوفة. لدراسة تأثير كل من هذه المعلمات ، من الضروري إنشاء نظام يمكن من خلاله تغيير معلمة واحدة بشكل مستقل. على سبيل المثال ، الثقافة المستكشفة ليست مناسبة لدراسة تشوه الخلية ، ولكن يمكن استخدامها لدراسة التأثير الكلي للضغط على النشاط الاستقلابي للغضروفية. ضغط الغضروف يؤدي إلى الخلية تشوه، ورافق أيضا من قبل وقوع الانحدار الهيدروليكي الضغط والجهد الكهربائي، وتدفق السوائل التغيير الفيزيائية عوامل مثل محتوى الماء في المصفوفة، وكثافة الشحنة الكهربائية، ومستوى الضغط الاسموزي. يمكن دراسة تشوه الخلية باستخدام غضروفية معزولة مغمورة في هلام agarose أو الكولاجين.

تم تطوير العديد من الأنظمة لدراسة تأثير التحفيز الميكانيكي على ثقافة الخلايا الغضروفية. يستخدم بعض الباحثين أنظمة لهذا الغرض حيث يتم تطبيق الضغط على زراعة الخلايا من خلال المرحلة الغازية. على سبيل المثال، JP Veldhuijzen وآخرون (1979) باستخدام الضغط فوق الغلاف الجوي من 13 كيلو باسكال في التردد المنخفض (0.3 هرتز) خلال 15 دقيقة، لاحظ زيادة في تخليق المخيم والبروتيوغليكان وخفض تخليق DNA. R. سميث وآخرون (1996) أظهرت أن التعرض المتقطع للثقافات الأولية من غضروفية الثور الضغط الهيدروليكي (10 ميجا باسكال) في 1 هرتز لمدة 4 ساعات تسببت في زيادة توليف aggrecan والكولاجين من النوع الثاني، في حين كان الضغط المستمر أي تأثير على هذه العمليات. باستخدام نظام مماثل M. رايت وآخرون (1996) أن ضغط الدوري على زراعة الخلايا ويرتبط مع فرط الاستقطاب غشاء الخلية من غضروفية وتفعيل الكالسيوم ²⁺ قنوات البوتاسيوم التي تعتمد على. وهكذا ، فإن تأثيرات الضغط الدوري تتوسطها القنوات الأيونية ، وتنشط بواسطة التمدد ، في غشاء الخلية الغضروفية. تعتمد استجابة الخلايا الغضروفية على الضغط الهيدروستاتيكي على ظروف زراعة الخلايا وتكرار الحمل المطبق. وبالتالي، الضغط الهيدروليكي دوري (5 ميجا باسكال) يقلل من إدماج كبريتات في أحادي الطبقة خلية غضروفية على تردد 0.05، 0.25 و 0.5 هرتز، أما بالنسبة للترددات فوق 0.5 هرتز كبريتات إدراجها في زيادات يزدرع الغضروف.

ذكر م. بوشمان وزملاؤه (1992) أن الخلايا الغضروفية في هلام الأغاروز تغير التركيب الحيوي استجابة للإجهاد الميكانيكي الساكن والديناميكي بنفس طريقة العضو السليم المستزرع. وجد الباحثون أن الحمل الميكانيكي يولد محفز فرط ، يتبعه انخفاض في الرقم الهيدروجيني في الخلايا الغضروفية.

يمكن دراسة تأثير التمدد الميكانيكي على ثقافة الخلايا المغمورة في هلام. يمكن إنشاء قوة التمدد باستخدام الفراغ المتحكم به بواسطة الكمبيوتر. عندما يكون النظام في فراغ من درجة معينة ، يتم تمديد الجزء السفلي من طبق بتري مع ثقافة الخلية بمقدار معين ، فإن التشوه هو الحد الأقصى عند حواف الجزء السفلي من الكأس ويكون الحد الأدنى في المركز. ينتقل تمدد وتربيتها في طبق بتري من الخلايا الغضروفية. وبمساعدة هذه الطريقة ، أظهر Holm-vall والمؤلفون المشاركون (1995) أن التعبير عن mRNA لـ α ₂ -integrin يزداد في خلايا الغضروف chondrosarcoma الجلدي (النوع الثاني) . و ₂ p _g integrin قادرة على الارتباط بنوع الكولاجين II. وهو يعتبر بمثابة مستقبِل ميكانيكي ، لأنه يتفاعل مع بروتينات رابطة الأكتين ، وبالتالي يربط بين ECM والهياكل الخلوية.

تأثير درجة الحموضة على استقلاب غضروفية

درجة الحموضة من السائل الخلالي من ECM للنسيج الغضروفي هو أكثر حمضية من الأنسجة الأخرى. حدد ماروداس (1980) الرقم الهيدروجيني للغضروف المفصلي عند 6.9. وجد دبليو ديامانت والمؤلفين المشاركين (1966) درجة الحموضة من 5.5 في الحالات المرضية. من المعروف أن الخلايا الغضروفية تعيش في منخفض PO2 ، مما يدل على الدور المهم للتحلل السكري (95٪ من إجمالي استقلاب الجلوكوز) في عملية التمثيل الغذائي لهذه الخلايا ؛ ويرافق التحلل السكري من إنتاج كمية كبيرة من حمض اللاكتيك.

بالإضافة إلى تحمض البيئة بمنتجات التحلل ، فإن مكونات المصفوفة نفسها ذات أهمية كبيرة. وهناك عدد كبير من شحنة سالبة ثابتة على الخلية البروتيوغليكان تعديل التركيب الايوني: هناك نسبة عالية من الكاتيونات مجانية (على سبيل المثال H ⁺ ، نا ⁺ ، K ⁺ ) وتركيز منخفض من الأنيونات (على سبيل المثال، O2، NPHS). بالإضافة إلى ذلك ، تحت تأثير الحمل الميكانيكي ، يتم طرد المياه من ECM ، مما يؤدي إلى زيادة في تركيز الرسوم السالبة الثابتة وجذب المزيد من الكاتيونات إلى المصفوفة. ويرافق هذا انخفاض في الرقم الهيدروجيني للوسط خارج الخلية ، والذي يؤثر على درجة الحموضة داخل الخلايا ، وبالتالي تعديل عملية التمثيل الغذائي للغضروفية. درس R. Wilkin و A. Hall (1995) تأثير الرقم الهيدروجيني للوسط خارج الخلوي وداخل الخلية على التخليق الحيوي للمصفوفة بواسطة غضروفية معزولة عن الثور. لاحظوا تعديل مزدوج لتخليق مصفوفة مع انخفاض في درجة الحموضة. انخفاض طفيف في درجة الحموضة (7.4 <درجة الحموضة <7.1) na50٪ زيادة إدماج ³⁵ S0 ₄ و ³ H-البرولين في غضروفية، في حين أن تحمض أعمق (درجة الحموضة <7.1) يمنع تركيب بنسبة 75٪ مقارنة مع السيطرة. خلق نفس الرقم الهيدروجيني منخفض (6.65) مع أيونات الأمونيوم تسبب في انخفاض في تركيب مصفوفة بنسبة 20 ٪ فقط. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن تعديل الرقم الهيدروجيني لوسط تخليق مصفوفة خارج الخلية لا يمكن تفسيره فقط بالتغيرات في الأس الهيدروجيني للوسط داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، غضروفية تمتلك القدرة على تنظيم درجة الحموضة داخل الخلايا نا ⁺ ، H ⁺ المبادلات، كا ⁺ التي تعتمد على C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS وH ⁺ / أتباز.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

تأثير تكوين الوسط للزراعة على استقلاب غضروفية

يجب أن تتوافق وسيلة زراعة الخلايا الغضروفية مع الظروف التجريبية. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام مصل العجل لتحسين ظروف الثقافة. ومع ذلك ، عند استخدام المصل ، ينبغي النظر في عدد من النقاط الهامة:

• النمو الخارجي للخلايا من محيط الأنسجة في ثقافات الأعضاء ،
• تقلب تكوين الأمصال من سلسلة مختلفة ،
• وجود مكونات غير معروفة فيها ،
• زيادة خطر التدخل ، والتحف في دراسة تأثير العوامل البيولوجية المختلفة على النشاط الأيضي للخلايا.

مثال على هذا الأخير هو دراسة تأثير EGF على غضروفية غضروف في الفئران. حفز EGF دمج ³ H-thymidine وزيادة محتوى الحمض النووي في الثقافة. كان هذا التأثير أكثر وضوحًا عند التركيزات المنخفضة في المصل (أقل من 1٪) ، ولكن بتركيزات عالية (> 7.5٪) اختفى التأثير.

ومن المعروف جيدا أن مستويات التوليف والتدهور في DMEM المخصب مع مصل العجل تزداد بشكل كبير مقارنة مع الظروف في الجسم الحي. الاختلافات بين التمثيل الغذائي في الجسم الحي و في المختبر يمكن أن يكون سبب الاختلافات بين السائل الزليلي والمتوسطة في الخلايا التي يتم تربيتها. كانت D. لي وآخرون (1997) غضروفية مثقف ثيران الاغاروز باستخدام وسط غذائي يحتوي على DMEM، المخصب مع 20٪ مصل العجل وعدد كبير من خيفي السائل الزليلي العادي. أدى وجود السائل الزليلي في الوسط إلى زيادة في عدد البروتيوغليكان ، حتى 80٪ من إجمالي كمية السائل الزليلي. وتشير هذه النتائج إلى أن السائل الزليلي في ثقافة يدفع معدل الأيض، مماثلة لتلك التي في الجسم الحي، مع مستويات عالية من تركيب الجليكوسامينوجليكان ومستويات منخفضة من انقسام الخلايا.

أظهرت G. فيربروجن وآخرون (1995) أن تركيب ³⁵ S-arrpeKaHa غضروفية البشرية المستزرعة في الاغاروز في DMEM دون المصل كان 20-30٪ من مستوى التوليف لوحظ في DMEM، على أن تستكمل مع 10٪ مصل العجل. تحديد المؤلفين مدى الذي IGF-1، IGF-2، TGF-P أو خفض aggrecan إنتاج الأنسولين في وسيط وبدون المصل. وخلص الباحثون إلى أن 100 نانوغرام مل الانسولين /، IGF-1 أو IGF-2 انخفاض جزئيا توليف aggrecan إلى 39-53٪ من مستويات الرقابة. مع مزيج من هذه العوامل ، لم يتم تحديد أي ظواهر تآزرية أو تراكمية. في نفس الوقت، و 10 نانوغرام / مل من TGF-P في وجود 100 نانوغرام / مل الانسولين حفز توليف aggrecan إلى 90٪ أو أكثر من المستوى المرجعي. أخيراً ، لم يؤثر ترانسفيرين المصل ، بمفرده أو بالاقتران مع الأنسولين ، على تخليق أغريغين. عندما تم استبدال مصل العجل بألبومين المصل البقري ، انخفض محتوى الكلي aggrecan بشكل كبير. مستنبت التخصيب مع الأنسولين، IGF، أو TGF-P استعادة جزء من قدرة الخلايا على إنتاج الركام aggrecan. في هذه الحالة ، IGF-1 والأنسولين قادران على الحفاظ على التوازن في مزارع الخلايا. بعد 40 يوما من الثقافة في المتوسط تستكمل مع 10-20 نانوغرام / مل IGF-1، واستمر التوليف بروتيوغليكان على نفس المستوى أو أعلى بالمقارنة مع المتوسط تحتوي على 20٪ مصل العجل. أقدمت عمليات الهدم ببطء في المتوسط تستكمل مع IGF-1 مما كانت عليه في المتوسط تستكمل مع 0.1٪ محلول الزلال، ولكن إلى حد ما أسرع في المتوسط تستكمل مع 20٪ مصل. في الثقافات طويلة العمر ، يحافظ 20 نانوغرام / مل IGF-1 على حالة مستقرة من الخلايا.

D. لي وآخرون (1993) مقارنة تأثير تكوين مستنبت (DMEM، DMEM + 20٪ مصل العجل، DMEM + 20 نانوغرام / مل IGF-1) على تخليق DNA في ثقافة الغضروف يزدرع والثقافة أحادي الطبقة ومعلق في الاغاروز . عندما المثقف في الاغاروز بحضور المؤلفين المصل لوحظ وجود اتجاه لتجميع غضروفية في تجمعات كبيرة. الخلايا المستزرعة دون المصل ومع IGF1، في الحفاظ على شكل دائري في الاغاروز، جمعت في مجموعات صغيرة، لكنها لم تشكل مجاميع كبيرة. في أحادي الطبقة ، كان تخليق الحمض النووي أعلى بشكل ملحوظ في الوسائط المحتوية على المصل منه في الوسط المخصب بـ IGF-1 ؛ كان توليف الحمض النووي في هذا الأخير أعلى بكثير من البيئة غير المخصبة. عندما زراعة غضروفية معلق في الاغاروز في المتوسط unconcentrated وفي المتوسط مع IGF-1، لا فرق في تركيب DNA. في نفس الوقت الطين زراعة غضروفية في الاغاروز في المتوسط تستكمل مع المصل، رافقه زيادة إدماج radionucleotide ³ H-الثيميدين بالمقارنة مع بيئات أخرى.

فيتامين ج ضروري لتنشيط الإنزيمات المشاركة في تشكيل هيكل لولبي مستقر من ألياف الكولاجين. الخلايا الغضروفية ، ناقص فيما يتعلق بحامض الأسكوربيك ، تخليق السلائف غير الحلزونية غير الهيدروكسيلية للكولاجين ، والتي يتم إفرازها ببطء. يتسبب إدخال حمض الأسكوربيك (50 ميكروغرام / مل) في حدوث هيدروكسيل من نوعي الكولاجين II و IX وإفرازهما بكميات عادية. إضافة فيتامين (ج) لم تؤثر على مستوى توليف بروتيوجليكان. وبالتالي ، يتم تنظيم إفراز الكولاجين بشكل مستقل عن إفراز بروتيوجليكان.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]