التشخيص المخبري لمرض السل

السل مرض يسهل تشخيصه في ظل الظروف الحديثة والإنجازات العلمية. ويحتل التشخيص المخبري لمرض السل مكانة محورية بين طرق التشخيص الأخرى، بعد طرق الفحص بالأشعة السينية.

[ 1 ]، [ 2 ]، [ 3 ]، [ 4 ]

فحص الدم السريري

في مرضى السل، لا تُعدّ التغيرات في فحص الدم العام علامةً مرضية. في الأشكال المحدودة ومنخفضة النشاط من السل، يُعدّ نقص تصبّغ كريات الدم الحمراء بعدد طبيعي سمةً مميزة. في حالات الارتشاحات الضخمة أو الالتهاب الرئوي الجبني، مع التهاب العقد اللمفاوية الجبني واسع الانتشار، وتلف الأمعاء النوعي، وكذلك مع النزيف الرئوي الكبير أو نزيف ما بعد الجراحة، تُلاحظ قلة تصبّغ الدم وصغر كريات الدم الحمراء، وقلة تصبّغ الدم، وكثرة تصبّغ الدم. أما كبر كريات الدم الحمراء، وخاصةً تَبَكُّل كريات الدم الحمراء، فهي أقل شيوعًا، وعادةً ما تكون مصحوبة بفقر دم شديد. يتراوح عدد الشبكيات في المرحلة المُعوّضة من السل بين 0.1% و0.6%، وفي المرحلة ناقصة التعويض - بين 0.6% و1%، وفي المرحلة غير المُعوّضة، تكون نسبة الشبكيات 1% سمةً مميزة.

في بعض حالات السل، قد يلاحظ زيادة معتدلة في عدد الكريات البيضاء (تصل إلى 15 ألف خلية بيضاء)، وفي حالات أقل شيوعاً نقص الكريات البيضاء، والذي يحدث في 2-7% من الحالات في المرضى الذين يعانون من أشكال محدودة وخفيفة من العملية وفي 12.5% في مرض السل الرئوي المدمر والتقدمي.

غالبًا ما تحدث تغيرات في تركيبة الكريات البيضاء. يُلاحظ وجود عدلات نسبية ومطلقة، مع تغير طفيف في تركيبة الكريات البيضاء نحو اليسار نحو الخلايا الطليعة النقوية. نادرًا ما تُلاحظ الخلايا الطلقية في حالات السل غير المعقد. تشير زيادة عدد العدلات ذات الحبيبات المرضية في مخطط الدم لمريض السل دائمًا إلى مدة العملية: في مرضى السل الحاد، تحتوي جميع العدلات تقريبًا على حبيبات مرضية. عندما يهدأ تفشي السل، يعود التحول النووي إلى طبيعته بسرعة نسبية. عادةً ما يستمر الحبيبات المرضية للعدلات لفترة أطول من التغيرات الأخرى في مخطط الدم.

يتقلب محتوى الخلايا الحمضية في الدم المحيطي أيضًا تبعًا لمرحلة المرض وحالة الجسم التحسسية. ينخفض عددها إلى حالة انعدام الحمضات في حالات تفشي المرض الشديدة والممتدة، وفي المقابل، يزداد خلال ارتشاح الصفائح الدموية وانصباب الجنبة، وكذلك في المراحل المبكرة من السل الأولي.

تصاحب معظم أشكال السل الأولي نقصًا في الخلايا الليمفاوية، والذي يُلاحظ أحيانًا لعدة سنوات حتى بعد ظهور ندوب تغيرات معينة. أما السل الثانوي في مرحلته الحادة، فقد يصاحبه إما عدد طبيعي من الخلايا الليمفاوية أو نقص في الخلايا الليمفاوية، وذلك حسب شدة الحالة.

من بين اختبارات تقييم تطور مرض السل، يحتل معدل ترسيب كريات الدم الحمراء (ESR) مكانة خاصة، وهو مهم لتقييم مسار مرض السل وتحديد أشكاله النشطة. تشير زيادة معدل ترسيب كريات الدم الحمراء إلى وجود عملية مرضية (مُعدية والتهابية، صديدي، إنتاني، داء أرومة الدم، ورم حبيبي لمفي، إلخ)، وتُعدّ مؤشرًا على شدتها، إلا أن قيم معدل ترسيب كريات الدم الحمراء الطبيعية لا تشير دائمًا إلى غياب المرض. يُسهّل ارتفاع نسبة الجلوبيولينات والفيبرينوجين والكوليسترول في الدم وانخفاض لزوجته تسريع ترسيب كريات الدم الحمراء. يُعدّ تباطؤ ترسيب كريات الدم الحمراء سمةً مميزةً للحالات المصحوبة بتركيز الدم، وزيادة نسبة الألبومينات والأحماض الصفراوية.

يتغير تصوير الدم لمرضى السل أثناء العلاج. كلما زاد نجاح التدخل العلاجي، زادت سرعة اختفاء التغيرات الدموية. في الوقت نفسه، يجب مراعاة تأثير مختلف الأدوية المضادة للبكتيريا على تكوين الدم. غالبًا ما تسبب هذه الأدوية فرط الحمضات، وفي بعض الحالات زيادة في عدد الكريات البيضاء، وفي أغلب الأحيان قلة الكريات البيضاء، وصولًا إلى ندرة المحببات وتفاعل الخلايا اللمفاوية الشبكية. يُعدّ الرصد الدموي المنهجي والتحليل الدقيق للبيانات المُحصّلة أمرًا أساسيًا لتقييم الحالة السريرية للمريض، وديناميكيات العملية العلاجية، وفعالية العلاج.

[ 5 ]، [ 6 ]، [ 7 ]، [ 8 ]، [ 9 ]

تحليل البول السريري

في حالة الإصابة بسل المسالك البولية، يُعد تحليل البول الطريقة التشخيصية المختبرية الرئيسية. يمكن ملاحظة كثرة الكريات البيضاء، وكثرة الكريات الحمراء، وكثرة البروتين في البول، وقلة البول، ووجود بكتيريا سلية في البول، ووجود بكتيريا غير محددة في البول.

يُعدّ كثرة الكريات البيضاء في البول العرض الأكثر شيوعًا لمرض السل في المسالك البولية قبل العلاج الكيميائي النوعي، ولا يُلاحظ إلا في حالات استثنائية، مثل انسداد تجويف الحالب تمامًا. يُساعد اختبار نيتشيبورينكو (تحديد عدد الكريات البيضاء في 1 مل من البول) على تقييم درجة كثرة الكريات البيضاء في مرض السل الكلوي بموضوعية أكبر، وفي بعض الحالات، يُمكّن من اكتشافه من خلال تحليل بول عام طبيعي. مع ذلك، يجب مراعاة أن كثرة الكريات البيضاء قد تحدث في حالات التهاب الحويضة والكلية الحاد والمزمن، والتهاب المثانة، والتهاب الإحليل، وحصوات الكلى، والحالب.

تُعتبر البيلة الدموية، مثل البيلة البيضاء، من أكثر العلامات المخبرية شيوعًا لمرض السل البولي التناسلي. يعتمد تواتر البيلة الدموية على مدى انتشار العملية، ويزداد مع تطور العملية السلية المُدمرة في الكلى. تُعدّ البيلة الدموية دون البيلة البيضاء أكثر شيوعًا في المراحل المبكرة من السل الكلوي. يُعدّ غلبة البيلة الدموية على البيلة البيضاء دليلًا مهمًا على الإصابة بالسل الكلوي عند تمييزه عن التهاب الحويضة والكلية غير النوعي.

[ 10 ]، [ 11 ]، [ 12 ]، [ 13 ]، [ 14 ]، [ 15 ]، [ 16 ]

اختبار الدم الكيميائي الحيوي

في مرض السل، تعتمد تغيرات بعض المؤشرات الكيميائية الحيوية بشكل أساسي على مرحلة المرض، والمضاعفات، والأمراض المصاحبة المختلفة. في مرضى السل غير النشط في الرئتين والأعضاء الأخرى، لا يتغير إجمالي البروتين ونسبته في مصل الدم، ويحدد محتواه الطبيعي.

في الأشكال الحادة من المرض، وكذلك في تفاقم وتقدم الأشكال المزمنة من مرض السل، ينخفض معامل الألبومين-الجلوبيولين.

يُعدّ تحديد مستوى البيليروبين المباشر والكلي، وإنزيمات ناقلة أمين الأسبارتات (AST)، وألانين ناقلة أمين الألانين (ALT) في مصل الدم أمرًا بالغ الأهمية في تقييم الحالة الوظيفية والضرر العضوي للكبد في حالات السل ومضاعفاته. ويُعدّ التحديد الديناميكي لمستوى إنزيمات ناقلة الأمين جزءًا أساسيًا من الفحص الكيميائي الحيوي لمرضى السل، وخاصةً في حالاته الشديدة، ويُجرى شهريًا.

يشمل تقييم الحالة الوظيفية للكلى تحديد مستوى الكرياتينين في المصل وحساب معدل الترشيح الكبيبي باستخدام معادلة كوكروفت-غولت. أما حساب معدل الترشيح الكبيبي باستخدام اختبار ريبيرغ، فيعطي نتائج أقل دقة.

الهدف الرئيسي للدراسات الكيميائية الحيوية الديناميكية للمرضى المصابين بالسل هو مراقبة مسار العملية والكشف في الوقت المناسب عن الآثار الجانبية للأدوية والتصحيح المناسب لاضطرابات التوازن الناشئة.

[ 17 ]، [ 18 ]، [ 19 ]

تطبيق أساليب البحث البيوكيميائية في مرض السل خارج الرئة

ويعتبر المؤشر الأكثر إفادة هو محتوى حمض السل في السوائل البيولوجية، ومع ذلك، يرتبط تحديده بالصعوبات التقنية (الحاجة إلى استخدام الغاز الكروماتوغرافيا ومطياف الكتلة).

من المُبشر قياس نشاط إنزيم أدينوسين دياميناز، وهو إنزيم يُحدد في السوائل: الزليلية، التامورية، الاستسقائية، أو النخاعية. الخلايا الليمفاوية والوحيدات هي الخلايا الرئيسية المُنتجة لأدينوسين دياميناز. يُسهّل تحديد نشاط إنزيم أدينوسين دياميناز في السوائل البيولوجية تشخيص التهاب الغشاء الزليلي السلي، وسل الغدد الليمفاوية، والتهاب السحايا السلي، والتهاب المصل السلي.

بعض المؤشرات الكيميائية الحيوية، نظرًا لعدم تحديدها بدقة، تُحدَّد فقط في السوائل البيولوجية القريبة من الآفة. يُقاس مستوى المؤشرات استجابةً لإعطاء التوبركولين تحت الجلد أو داخله (عادةً قبل الإعطاء وبعده بـ 48 و72 ساعة). بعد ذلك، تُحسب نسبة الزيادة في مستوى المؤشر (%) مقارنةً بالمستوى الأولي.

في الحالة المثلى، يُحدَّد نشاط إنزيم الترانساميديناز الخاص بكل عضو في البول؛ ويُلاحَظ ظهوره في تلف الكلى من منشأ مختلف. لا تُبرَّر دراسة الترانساميديناز إلا في حالات إعطاء التوبركولين تحت الجلد لتفاقم العملية الالتهابية الموضعية. يُحدَّد نشاط الترانساميديناز في البول في البداية، وبعد 24-72 ساعة من إعطاء 50 TE من التوبركولين. زيادة تخمر البول بمقدار ضعفين أو أكثر تُمكِّن في 82% من الحالات من التمييز بين السل النشط في الكلى وتفاقم التهاب الحويضة والكلية المزمن.

في حالة الإصابة بالسل في الأعضاء التناسلية الأنثوية، تُحدد تركيزات الهابتوغلوبين والمالونديالدهيد في الدم باستخدام اختبار التوبركولين الاستفزازي. يُعطى التوبركولين تحت الجلد بجرعة 50 وحدة دولية، وتُجرى دراسة بيوكيميائية مُكررة بعد 72 ساعة. في حالة وجود سبب سلّي، تكون درجة الزيادة في مستوى الهابتوغلوبين 28% على الأقل، ومستوى المالونديالدهيد 39% أو أكثر. يُستخدم أيضًا تحديد نشاط أدينوسين دياميناز في السائل البريتوني المُستخرج من جيب دوغلاس. يُفحص الوخز مرة أخرى بعد 72 ساعة من إعطاء التوبركولين داخل الجلد بجرعتين 0.1 وحدة دولية و0.01 وحدة دولية في منطقة بروز الأعضاء التناسلية الداخلية على جدار البطن الأمامي. تشير الزيادة في نشاط أدينوسين ديميناز بنسبة 10% أو أكثر مقارنة بالقيمة الأولية إلى وجود عملية سل.

في حالة تلف العين، يُفحص التفاعل البؤري الذي يحدث في العين استجابةً لتحفيز المستضد. في هذه الحالة، من غير المرغوب فيه ظهور استجابة حادة مصحوبة بانخفاض في الوظائف البصرية. ونظرًا لصعوبة تقييم التفاعلات البؤرية البسيطة في كثير من الأحيان، يُنصح بالتركيز بالتوازي على درجة زيادة الهابتوغلوبين أو أدينوسين دياميناز في مصل الدم لتوضيح النتيجة.

ينبغي إجراء جميع الدراسات الكيميائية الحيوية بالاشتراك مع أساليب أخرى.

[ 20 ]، [ 21 ]، [ 22 ]، [ 23 ]

دراسة نظام تخثر الدم

تكمن أهمية دراسة حالة نظام تخثر الدم في طب الأمراض الجلدية في وجود نفث دم أو نزيف رئوي لدى عدد من مرضى السل الرئوي، بالإضافة إلى مضاعفات تخثر الدم في العلاج الجراحي للسل. إضافةً إلى ذلك، يؤثر تخثر الدم الكامن داخل الأوعية الدموية، المصاحب طبيعيًا، على مسار المرض وفعالية العلاج الكيميائي.

لدى مرضى السل الرئوي الذين يغلب عليهم عامل الالتهاب الإفرازي، يُلاحظ انخفاض في نشاط مضادات التخثر في الدم. أما لدى المرضى الذين يعانون من انخفاض معدل انتشار تلف الرئة النوعي مع وجود عامل الالتهاب الإنتاجي السائد، فيكون التعبير عن تخثر الدم داخل الأوعية الدموية ضئيلاً. أما لدى مرضى السل الرئوي الذين يعانون من نفث الدم والنزيف الرئوي، فتختلف حالة نظام تخثر الدم: ففي المرضى الذين يعانون من فقدان دم طفيف في ذروة نفث الدم أو بعد توقفه مباشرةً، تُلاحظ زيادة حادة في قدرة الدم على التخثر نتيجةً لتكثيف عمليات تكوين الثرومبين بشكل ملحوظ مع الحفاظ على زيادة قابلية التخثر "الهيكلية". أما لدى المرضى الذين يعانون من فقدان دم غزير، فيُلاحظ انخفاض في إمكانية التخثر نتيجةً لانخفاض تركيز الفيبرينوجين، ونشاط العامل الثالث عشر، وعدد الصفائح الدموية. في مرحلة العلاج الجراحي، لا تحدث اضطرابات كبيرة في نظام التوازن الداخلي لدى مرضى السل الرئوي ذوي الأشكال المحدودة. أما لدى المرضى ذوي الأورام المنتشرة، فغالبًا ما تتطور متلازمة DIC عند إجراء استئصال الرئة أو استئصال الجنبة الرئوي، والتي قد تتخذ شكل "مرض ثانوي".

لمراقبة حالة نظام تخثر الدم لدى مرضى السل الرئوي، من الضروري تحديد زمن الثرومبوبلاستين الجزئي المنشط (APTT)، والفيبرينوجين، وزمن الثرومبين، ومؤشر البروثرومبين، بالإضافة إلى زمن النزيف وزمن تخثر الدم.

[ 24 ]، [ 25 ]، [ 26 ]، [ 27 ]، [ 28 ]

الدراسات الهرمونية

تشير الملاحظات التجريبية والسريرية الحديثة إلى وجود تغيرات في الحالة الهرمونية في حالات التهاب السل الرئوي المحددة. وقد ثبت أن تصحيح خلل وظائف الغدة النخامية-الكظرية، والغدة النخامية-الدرقية، ووظائف البنكرياس، بالتزامن مع العلاج المضاد للسل، يُسهم في تنشيط التليف وعمليات الإصلاح في بؤرة الالتهاب المحددة.

يُحكم على الحالة الوظيفية لجهاز الغدة النخامية الدرقية من خلال محتوى ثلاثي يودوثيرونين (T3)، والثيروكسين (T4)، وهرمون الغدة النخامية المحفز للغدة الدرقية (TSH) في مصل الدم _. وقد _ثبت أن قصور الغدة الدرقية دون السريري يُكتشف لدى 38-45% من مرضى السل الرئوي، ويُشخص غالبًا في الأشكال المنتشرة والليفية الكهفية من العملية. في هذه الأشكال، تنخفض مستويات كل من T3 وT4 بشكل حاد _، ويحدث _خلل في توازن هذه الهرمونات على شكل زيادة في _{نسبة T4إلى} T3.

تُقيّم وظيفة قشرة الغدة الكظرية بمستوى الكورتيزول في المصل، وتُقيّم وظيفة البنكرياس الصماء بتركيز الأنسولين المناعي. في المرحلة الحادة من المرض المعدي، تزداد الحاجة إلى الكورتيزول الداخلي والأنسولين. كما يُشير فرط الأنسولين في الدم إلى مقاومة أنسجة الجسم للأنسولين، وهو أمر شائع في أي عملية التهابية نشطة، وخاصةً عملية التهابية محددة. يسمح لنا تحديد وظيفة الجلوكوكورتيكويد في الغدد الكظرية في مرض السل الرئوي النشط باكتشاف وجود فرط قشر الكظر لدى معظم المرضى. ينبغي اعتبار تركيزات الكورتيزول الطبيعية في الدم لدى مريض مصاب بالتهاب معدي في المرحلة الحادة قصورًا نسبيًا في وظيفة الجلوكوكورتيكويد في قشرة الغدة الكظرية، والذي يمكن أن يُشكل أساسًا للعلاج التعويضي بجرعات كافية من الجلوكوكورتيكويد.

يعاني ما يقرب من ثلث مرضى السل الرئوي من انخفاض مستوى الأنسولين في الدم، والذي يقترب من الحد الأدنى الطبيعي، بينما يعاني ما بين 13% و20% منهم من فرط الأنسولينية الحاد. يُعدّ كلٌّ من نقص الأنسولين النسبي وفرط الأنسولينية من عوامل الخطر العالية للإصابة باضطرابات استقلاب الكربوهيدرات بدرجات متفاوتة من الشدة. تتطلب هذه التغيرات في النشاط الوظيفي لخلايا البنكرياس البائية مراقبة منتظمة لسكر الدم لدى مرضى السل والوقاية من داء السكري في الوقت المناسب. بالإضافة إلى ذلك، يُمثّل هذا مبررًا إضافيًا لملاءمة استخدام جرعات فسيولوجية من الأنسولين في العلاج المعقد لمرض السل.

بشكل عام، يكون انخفاض مستويات هرمون الغدة الدرقية واختلال توازنها وفرط كورتيزول الدم وفرط الأنسولين أكثر وضوحًا لدى المرضى الذين يعانون من مسار حاد لعملية السل، مع آفات رئوية واسعة النطاق وأعراض واضحة للتسمم بالسل.

التشخيص الميكروبيولوجي لمرض السل

تعتبر الدراسات الميكروبيولوجية ضرورية لتحديد المرضى المصابين بالسل، والتحقق من التشخيص، ومراقبة العلاج الكيميائي وتصحيحه، وتقييم نتائج العلاج، أي من لحظة تسجيل مريض السل حتى إزالته من السجل.

تعتمد جميع البرامج والمشاريع الوبائية على تقييم عدد البكتيريا المُفرزة، وهو أمرٌ لا يُمكن تحقيقه دون استخدام الطرق المخبرية للكشف عن بكتيريا السل. عند دراسة جاذبية ما يُسمى بالسكان غير المنظمين، تصل نسبة البكتيريا المُفرزة إلى 70 أو أكثر، مما يجعل الطرق المخبرية وسيلةً فعّالة إلى حدٍّ ما في تحديد مرضى السل ضمن هذه الفئة السكانية.

تشمل الطرق الميكروبيولوجية التقليدية لتشخيص السلّ الدراسات البكتيرية والزراعية. أما الطرق الحديثة فتشمل زراعة بكتيريا السلّ في أنظمة آلية وتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ومع ذلك، تُدمج جميع هذه الطرق بالضرورة مع الطرق البكتريولوجية التقليدية.

مجموعة من المواد التشخيصية

تعتمد فعالية الفحوص المخبرية بشكل كبير على جودة المواد التشخيصية. ويؤثر الالتزام بقواعد جمع وتخزين ونقل المواد التشخيصية، والتنفيذ الدقيق لخوارزمية فحص المريض، بشكل مباشر على النتيجة ويضمن السلامة البيولوجية.

تُستخدم مواد متنوعة لاختبار السل. ولأن السل الرئوي هو الشكل الأكثر شيوعًا للعدوى السلية، فإن المادة الرئيسية للاختبار هي البلغم وأنواع أخرى من إفرازات القصبة الهوائية والشعب الهوائية: إفرازات الجهاز التنفسي العلوي الناتجة عن استنشاق الرذاذ: مياه غسيل القصبات الهوائية؛ غسلات القصبات الهوائية؛ المواد المأخوذة أثناء تنظير القصبات الهوائية، وخزعات القصبة الهوائية وداخل الرئة: شفط القصبات الهوائية، لطاخات الحنجرة، الإفرازات، لطاخات الجروح، إلخ.

تزداد فعالية البحث بجمع المواد من المريض بشكل مُتحكّم. ولهذا الغرض، تُخصّص غرفة مُجهّزة خصيصًا أو تُشترى كبائن خاصة. يُعدّ جمع المواد إجراءً خطيرًا، لذا يجب جمعها وفقًا لقواعد السلامة من العدوى.

يتم جمع المواد المستخدمة في اختبار المتفطرة السلية في قوارير معقمة ذات أغطية محكمة الإغلاق لمنع تلوث البيئة وحماية المواد المجمعة من التلوث.

يجب أن تفي القوارير المستخدمة لجمع المواد التشخيصية بالمتطلبات التالية:

• يجب أن تكون مصنوعة من مادة مقاومة للصدمات؛
• يجب أن تذوب بسهولة عند التعقيم بالبخار؛
• يجب أن يكون حجمها كافياً (40-50 مل):
• - أن يكون لها فتحة واسعة لجمع البلغم (قطرها لا يقل عن 30 مم)؛
• أن يكون سهل التعامل معه، شفافًا أو شبه شفاف، بحيث يمكن تقييم كمية ونوعية العينة المجمعة دون فتح الغطاء.

للحصول على نتائج بحثية مثالية يجب توافر الشروط التالية:

• ينبغي أن يتم جمع المواد قبل بدء العلاج الكيميائي؛
• يجب جمع المواد الخاصة بالدراسة قبل تناول الطعام أو الأدوية في الصباح؛
• لإجراء الدراسة، يُنصح بجمع ثلاث عينات من البلغم الصباحي على الأقل. يُجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية؛
• يجب تسليم المواد المجمعة إلى المختبر في أسرع وقت ممكن:
• في الحالات التي لا يمكن فيها تسليم المادة إلى المختبر على الفور، يتم تخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة هواء تبلغ 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 48 ساعة؛
• عند نقل المواد، من الضروري الاهتمام بشكل خاص بسلامة الزجاجات.

البلغم المُجمّع بشكل صحيح له طابع مخاطي أو مخاطي صديدي. الحجم الأمثل للجزء المُفحص من البلغم هو 3-5 مل.

يُجمع البلغم تحت إشراف أخصائي صحي. يجب على المسؤولين عن جمع البلغم التأكد من اتباع بعض القواعد:

• من الضروري شرح غرض الفحص للمريض، وضرورة إخراج محتويات الأجزاء العميقة من الجهاز التنفسي، لا اللعاب أو المخاط الأنفي البلعومي. يمكن تحقيق ذلك من خلال السعال المُنتج للبلغم الذي يحدث بعد عدة (2-3) أنفاس عميقة. كما يجب تحذير المريض من ضرورة مضمضة فمه بالماء المغلي أولاً لإزالة الجزء الرئيسي من البكتيريا النابتة في تجويف الفم، وبقايا الطعام التي تُعقّد فحص البلغم.
• يجب على العامل الطبي المسؤول عن جمع البلغم أن يرتدي بالإضافة إلى ثوب وقبعة، قناعًا وقفازات مطاطية ومئزرًا مطاطيًا؛
• - الوقوف خلف المريض، وينصح بمسك الزجاجة بالقرب من شفتيه قدر الإمكان وفصل البلغم فيها فورًا أثناء السعال، مع ضرورة التأكد من توجيه تدفق الهواء بعيدًا عن العامل الصحي:
• بعد اكتمال جمع البلغم، يُغلق العامل الصحي الزجاجة بغطاءها بعناية، ويُقيّم كمية وجودة البلغم المُجمع. ثم تُلصق على الزجاجة مُلصقة، وتُوضع في صندوق خاص لنقلها إلى المختبر.

إذا لم يُخرج المريض بلغمًا، في الليلة السابقة وفي الصباح الباكر من يوم جمع العينة، يجب إعطاؤه مقشعًا: خلاصة جذور الخطمي (موكالتين)، أو برومهيكسين، أو أمبروكسول، إلخ، أو استخدام استنشاق مهيج، باستخدام معدات مُجهزة في غرفة جمع البلغم. لا تخضع العينة المجمعة بهذه الطريقة للحفظ، ويجب فحصها في يوم جمعها. لتجنب رفضها في المختبر، يجب تدوين ملاحظة خاصة في الإحالة.

في حال عدم إجراء دراسات ميكروبيولوجية في مؤسسة ما، يجب تسليم المواد التشخيصية المجمعة إلى المختبر مركزيًا، شريطة حفظها في الثلاجة أو مع مواد حافظة بين عمليات التسليم. تُسلم المواد إلى المختبر في صناديق نقل سهلة التعقيم. يجب تزويد كل عينة بملصق مناسب، ويجب أن تكون الدفعة بأكملها مكتملة النموذج المرفق.

[ 29 ]، [ 30 ]، [ 31 ]

طرق وتكرار فحص المرضى

خلال الفحص الأولي، ما يسمى بالفحص التشخيصي، للمريض بحثًا عن مرض السل، من الضروري فحص ما لا يقل عن 3 أجزاء من البلغم التي تم جمعها تحت إشراف الطاقم الطبي على مدار يومين أو ثلاثة أيام، مما يزيد من فعالية الفحص المجهري.

ينبغي إجراء الفحص الأولي لمرض السل في جميع المؤسسات الطبية والتشخيصية التابعة لنظام الرعاية الصحية. ولزيادة فعالية الفحص الأولي، تم مؤخرًا إنشاء ما يُسمى بمراكز الفحص المجهري، استنادًا إلى مختبرات التشخيص السريري، المجهزة بأحدث المجاهر والمعدات لضمان السلامة من الأوبئة.

تستخدم مؤسسات مكافحة السل نظام مسح يتضمن فحص البلغم أو أي مواد تشخيصية أخرى ثلاث مرات على الأقل خلال ثلاثة أيام. خلال فترة العلاج، تُجرى الدراسات الميكروبيولوجية بانتظام مرة واحدة على الأقل شهريًا في مرحلة العلاج الكيميائي المكثف. عند الانتقال إلى مرحلة المتابعة، تُجرى الدراسات بوتيرة أقل - كل شهرين إلى ثلاثة أشهر، بينما يُقلل تواترها إلى مرتين.

خصائص جمع المواد التشخيصية لمرض السل خارج الرئة

من سمات المواد المرضية في الأشكال خارج الرئة من مرض السل هو انخفاض تركيز بكتيريا السل فيها، الأمر الذي يتطلب أساليب أكثر حساسية للبحث الميكروبيولوجي، وفي المقام الأول أساليب البذر على وسط مغذي.

في حالة السل البولي التناسلي، يُعدّ البول المادة الأكثر سهولةً للفحص. يجب أن يقوم ممرض مُدرّب خصيصًا بجمع البول.

تُغسل الأعضاء التناسلية الخارجية بالماء والصابون أو بمحلول ضعيف من برمنجنات البوتاسيوم. تُعالَج الفتحة الخارجية للإحليل بعناية. يُجمع الجزء الأوسط من بول الصباح في زجاجة معقمة: للرجال - عادةً، وللنساء - باستخدام قسطرة. يُجمع بول حوض الكلية في أنابيب اختبار معقمة أثناء قسطرة كلية أو كليهما، وفي الحالة الأخيرة - بالضرورة بشكل منفصل عن كل كلية. تُطرد كمية صغيرة من هذا البول بالطرد المركزي، وتُفحص الرواسب.

عند الرجال، تُطرد الحيوانات المنوية، وثقوب الخصيتين، وإفرازات البروستاتا بالطرد المركزي للحصول على رواسب. عند وجود أي عملية محددة في منطقة الأعضاء التناسلية لدى الرجال، يمكن لتدليك البروستاتا أن يُعزز إطلاق الإفرازات التي تحتوي على بكتيريا السل.

يُجمع دم الحيض من النساء بالشفط أو باستخدام غطاء كافكا. تُفصل المادة الناتجة عن كريات الدم الحمراء بغسلها بالماء المقطر ثم تُطرد مركزيًا. تُفحص الرواسب.

يتم جمع إفرازات قناة عنق الرحم في حاوية أو غطاء كافكا، أي أنه من المستحسن تجميع 1-2 مل من المواد المرضية.

تُجَنَّس المواد المُستَخلَصة من التدخلات الجراحية في الكلى والأعضاء التناسلية والخزعات وكشطات بطانة الرحم. للقيام بذلك، تُوضَع في ملاط معقم وتُسحق جيدًا بمقص معقم. يُضاف رمل نهري معقم إلى المُعَلَّق الناتج بكمية تساوي كتلته، ثم يُضاف 0.5-1.0 مل من محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر، ويُطحن الكل حتى تتكون كتلة طرية مع إضافة محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر (4-5 مل). ثم تُترك الكتلة لتستقر لمدة دقيقة إلى دقيقة ونصف، ويُفحص السائل الطافي.

سُلّ العظام والمفاصل. يُوضع الوخز (القيح الناتج عن الخراجات) المُستخرج باستخدام محقنة معقمة في وعاء معقم ويُسلّم فورًا إلى المختبر. باستخدام ماصة معقمة، مُبللة مسبقًا بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر، يُؤخذ 2-5 مل من القيح، ويُنقل إلى زجاجة بها حبيبات، ويُضاف 2-3 مل أخرى من محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر. تُغلق الزجاجة بسدادة، وتُرجّ في رجّاز لمدة 8-10 دقائق. يُفحص المُعلق المُتجانس.

في حالات السل العظمي المفصلي الناسوري، يُسحب القيح من الناسور. تُجمع الإفرازات الغزيرة مباشرةً في أنبوب اختبار. في حالات الإفرازات القليلة، يُغسل مجرى الناسور بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر المعقم، وتُرسل الغسلات التي تُجمع في أنبوب اختبار أو قطعة من السدادة القطنية المبللة بالقيح للفحص.

قد تتكون المواد الجراحية المُستحصل عليها أثناء التدخلات الجراحية على العظام والمفاصل من كتل قيحية نخرية، وحبيبات، وأنسجة ندبية، وأنسجة عظمية، وأنسجة غشاء زليلي، وغيرها من الركائز. وتُجرى معالجتها كما هو الحال في حالة السل الكلوي.

يتم إجراء الفحص الميكروبيولوجي للسائل الزليلي في محلول سترات الصوديوم 3٪ (بنسبة 1: 1) لمنع التجلط مباشرة بعد البزل.

سُلّ الغدد الليمفاوية. يُفحص القيح المُستخرج أثناء ثقب الغدد الليمفاوية بنفس طريقة فحص القيح من الخراجات. تُفحص أنسجة الغدد الليمفاوية المُستخرجة أثناء التدخلات الجراحية والخزعات كما هو الحال في أنواع أخرى من السل.

يتم إجراء دراسة البراز لمرض السل بشكل نادر للغاية بسبب الغياب شبه الكامل للنتائج الإيجابية.

[ 32 ]، [ 33 ]، [ 34 ]، [ 35 ]، [ 36 ]

مجهر البكتيريا الفطرية

يُعد فحص البلغم المجهري طريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة نسبيًا، ويُنصح باستخدامها في جميع الحالات التي يُشتبه فيها بالإصابة بالسل. كما تُجرى هذه الدراسة لتقييم فعالية العلاج الكيميائي، ولتأكيد الشفاء أو فشل العلاج في حال عدم ظهور نتائج المزرعة.

يتم استخدام طريقتين للفحص المجهري:

• طريقة المجهر المباشر، عندما يتم تحضير لطاخة مباشرة من المادة التشخيصية؛
• طريقة الفحص المجهري للرواسب المحضرة من مادة معالجة بمواد مطهرة لأغراض البحث الثقافي.

يتم استخدام الطريقة الأولى في تلك المختبرات التي يتم فيها إجراء الدراسات المجهرية فقط (مختبرات التشخيص السريري للشبكة الطبية العامة).

يتم الحصول على أفضل نتائج الفحص المجهري عن طريق تركيز المادة التشخيصية (على سبيل المثال، عن طريق الطرد المركزي).

للكشف عن المتفطرة السلية بنسبة ٥٠٪ باستخدام المجهر، يجب أن يحتوي ١ مل من البلغم على أكثر من ٥٠٠٠ خلية ميكروبية. عادةً ما يحتوي بلغم مرضى السل الرئوي على عدد كبير من البكتيريا المقاومة للحموضة، مما يسمح باكتشافها بدقة باستخدام تنظير البكتيريا. يمكن زيادة دقة التشخيص لهذه الطريقة بفحص عدة عينات من البلغم من مريض واحد. لا تستبعد النتيجة السلبية لفحص البكتيريا تشخيص السل، لأن بلغم بعض المرضى يحتوي على كمية أقل من المتفطرة مما يمكن اكتشافه باستخدام المجهر. كما قد يكون سوء تحضير مسحات البلغم سببًا لنتيجة سلبية لفحص البكتيريا.

الطريقة الأكثر شيوعًا للكشف عن المتفطرات المقاومة للأحماض في اللطاخة هي صبغة زيل-نيلسن. تعتمد هذه الطريقة على اختراق كاربول فوكسين للخلية الميكروبية عبر غشاء يحتوي على طبقة شمعية دهنية، مع التأثير المتزامن للتسخين وتأثير النقش القوي للفينول. يؤدي إزالة اللون من اللطاخة لاحقًا بمحلول حمض الكبريتيك بتركيز 25% أو كحول الهيدروكلوريك بتركيز 3% إلى إزالة لون جميع التراكيب غير المقاومة للأحماض. تُصبغ العناصر المُزال لونها من اللطاخة بمحلول أزرق الميثيلين بتركيز 0.3%. لا تتفاعل المتفطرات مع أصباغ الأنيلين التقليدية، ونتيجة لذلك تُصبغ المتفطرات المقاومة للأحماض باللون الأحمر التوتي، بينما تُصبغ الميكروبات والعناصر الخلوية الأخرى باللون الأزرق.

لفحص اللطاخات المصبوغة وفقًا لمعيار تسيل-نيلسن، يُستخدم مجهر ضوئي ثنائي العينة مزود بعدسة غمر (تكبير 90 أو 100 ضعف) وعدسة عينية بتكبير 7 أو 10 أضعاف. يُفحص 100 مجال رؤية، وهو ما يكفي للكشف عن بكتيريا متفطرة واحدة في اللطاخة. إذا كانت نتيجة هذا الفحص سلبية، يُنصح بفحص 200 مجال رؤية إضافي للتأكيد. تُسجل النتائج، موضحةً عدد البكتيريا المقاومة للحمض (AFB) المكتشفة.

بالإضافة إلى هذه الطريقة، تُستخدم صبغة الفلوروكروم في المجهر الضوئي، مما يسمح بتحقيق أفضل النتائج. يزيد استخدام هذه الطريقة من كفاءة المجهر بنسبة 10-15%. عند معالجة المتفطرات بالأصباغ الضوئية (الأورامين، والرودامين، إلخ)، ترتبط هذه المواد أيضًا بالهياكل الشبيهة بالشمع للخلية الميكروبية. عند تعريض الخلايا الملطخة لمصدر ضوء مثير (طيف معين من الأشعة فوق البنفسجية)، فإنها تبدأ في التوهج باللون البرتقالي أو الأحمر الفاتح على خلفية سوداء أو خضراء داكنة. بفضل السطوع والتباين العاليين للصورة المرئية، يمكن تقليل التكبير الكلي للمجهر بمقدار 4-10 مرات، مما يوسع مجال الرؤية ويقلل من وقت مشاهدة التحضير. إلى جانب ذلك، وبفضل عمق المجال الأكبر بكثير، يمكن زيادة راحة الدراسة.

عند استخدام المجهر الفلوري، يستغرق فحص نفس المنطقة من اللطاخة وقتًا أقل بكثير من فحص اللطاخات المصبوغة بالمجهر الضوئي وفقًا لزيل-نيلسن. إذا فحص فني المجهر ما يقارب 20-25 لطاخة خلال يوم عمل واحد، فبمساعدة المجهر الفلوري، يمكنه فحص أكثر من 60-80 عينة في الوقت نفسه. يعلم فنيو المجهر ذوو الخبرة أن تلوين الخلايا بمزيج من الأورامين والرودامين له تأثير خاص على المتفطرات المقاومة للأحماض، والتي تبدو في هذه الحالة كقضبان ذهبية. أما الجراثيم المترممة، فتُصبغ باللون الأخضر.

ميزة أخرى مهمة لطريقة المجهر الفلوري هي القدرة على اكتشاف البكتيريا الفطرية المتغيرة التي فقدت خصائصها المقاومة للأحماض تحت تأثير عدد من العوامل غير المواتية، وخاصة العلاج الكيميائي المكثف، وبالتالي لا يتم اكتشافها بواسطة صبغة Ziehl-Neelsen.

تشمل عيوب طريقة المجهر الفلوري التكلفة العالية نسبيًا للمجهر وتشغيله. ومع ذلك، في المختبرات المركزية أو المختبرات الكبيرة الأخرى، حيث يتجاوز عبء العمل المعتاد لثلاثة فنيين مختبريين يعملون بثلاثة مجاهر تقليدية، يكون استخدام مجهر فلوري واحد أقل تكلفة.

تتميز طرق الفحص البكتيري بخصوصية عالية نسبيًا (89-100%). حوالي 97% من النتائج الإيجابية التي يتم الحصول عليها بأي طريقة مجهرية يتم تأكيدها بوضوح من خلال نتائج البذر.

تجدر الإشارة إلى أن الفحص المجهري لعينة من المادة المرضية لا يسمح بتحديد نوع المتفطرات المقاومة للأحماض المكتشفة. تتيح الطريقة المجهرية فقط استنتاج وجود أو عدم وجود كائنات دقيقة مقاومة للأحماض في المستحضر، وهو ما يُفسره وجود عدد كبير من الكائنات الدقيقة المقاومة للأحماض غير السلية في الطبيعة، والتي تشبه شكليًا متفطرات مرض السل.

يتم تقييم نتائج المجهر في وحدات شبه كمية.

لمقارنة نتائج مختلف طرق الفحص المجهري، تُستخدَم معاملات تجريبية. على سبيل المثال، لمقارنة نتائج مسحة مصبوغة بأصباغ فلورية مع بيانات دراسة مجهرية ضوئية (تكبير 1000 ضعف)، يلزم قسمة عدد المتفطرات المقاومة للأحماض المكتشفة باستخدام مجهر فلوري على المعامل المقابل: عند تكبير المجهر 250 ضعفًا - 10 أضعاف، وعند تكبير 450 ضعفًا - 4 أضعاف، وعند تكبير 630 ضعفًا - 2 ضعف.

خصائص المجهر في مرض السل خارج الرئة

يُجرى الفحص المجهري المباشر، بالإضافة إلى الفحص المجهري للمسحات المُحضرة بعد التخصيب مع التلوين اللاحق باستخدام صبغة زيل-نيلسن أو الأصباغ الفلورية. يُعد الفحص المجهري المباشر للمسحات غير فعال نظرًا لانخفاض تركيز البكتيريا الفطرية في المادة، لذا يُنصح باستخدام طرق التخصيب. يُعد الطرد المركزي الأكثر فعالية. إذا كانت المادة البيولوجية لزجة، يُستخدم الطرد المركزي مع التجانس والتسييل المتزامنين للمادة، والذي يتم باستخدام أجهزة طرد مركزي عالية السرعة بقوة طرد مركزي تبلغ 3000 غرام ومحاليل هيبوكلوريت. لا تُستخدم حاليًا طرق تخصيب أخرى، مثل التعويم الدقيق، نظرًا لتكوين الهباء الجوي ذي الخطورة البيولوجية.

[ 37 ]

طريقة الثقافة لتشخيص مرض السل

طريقة البذر، أو طريقة الزراعة، أكثر حساسية من مجهر اللطاخة، وتتميز بمزايا عديدة. فهي تتيح الكشف عن عشرات من المتفطرات الحية في المادة المراد فحصها، ولها قيمة تشخيصية عالية. ويكتسب هذا أهمية خاصة عند فحص عينات من مرضى حديثي التشخيص أو العلاج، ممن يُفرزون عددًا قليلًا من المتفطرات.

مقارنةً بالفحص المجهري، يُتيح البحث عن طريق زراعة العينات زيادة عدد مرضى السل المُكتشفين بنسبة تزيد عن 15-25%، بالإضافة إلى التحقق من الإصابة بالسل في مراحله المبكرة، عندما يكون المرض لا يزال قابلاً للعلاج بسهولة. ومن أهم مزايا البحث عن زراعة العينات إمكانية الحصول على عينة من مُسببات الأمراض، والتي يُمكن تحديدها ودراستها من حيث حساسية الدواء وشدته وخصائصه البيولوجية الأخرى.

تشمل عيوب طرق الزراعة مدتها (تصل فترة الانتظار للمواد إلى 10 أسابيع)، والتكلفة الأعلى، وتعقيد معالجة المواد التشخيصية.

مبادئ معالجة المواد التشخيصية قبل الزراعة

لا يُمكن استخدام الطرق الميكروبيولوجية التقليدية لإجراء اختبارات السل. ويعود ذلك إلى أن بكتيريا السل تنمو ببطء شديد، وتحتوي معظم العينات السريرية على كائنات دقيقة وفطريات سريعة النمو، مُقيحية ومتفسخة. ويؤثر نموها السريع على بيئات غنية بالمغذيات على نمو البكتيريا، ولا يسمح بعزل مُسببات مرض السل، لذا يجب معالجة المادة التشخيصية مسبقًا قبل الزراعة. إضافةً إلى ذلك، عادةً ما تكون البكتيريا المُنطلقة من الجهاز التنفسي للمريض مُحاطة بكمية كبيرة من المخاط، مما يُصعّب تركيزها. وفي هذا الصدد، يجب تسييل البلغم والمواد المماثلة وتطهيرها قبل بذرها.

جميع المنظفات والمطهرات لها تأثير سامّ بدرجة أو بأخرى على البكتيريا الفطرية. نتيجةً للمعالجة، قد تموت ما يصل إلى 90% من البكتيريا الفطرية. وللحفاظ على نسبة كافية من البكتيريا الفطرية، من الضروري استخدام طرق معالجة لطيفة تُمكّن، من جهة، من قمع الكائنات الدقيقة سريعة النمو المُقيحية والمتعفنة، ومن جهة أخرى، من الحفاظ على حيوية البكتيريا الفطرية الموجودة في المادة إلى أقصى حد.

اعتمادًا على المادة وتجانسها ومستوى التلوث، تُستخدم مُزيلات ملوثات مُختلفة لمعالجة ما قبل البذر: للبلغم - محلول هيدروكسيد الصوديوم 4%، ومحاليل فوسفات ثلاثي الصوديوم 10%، وكلوريد البنزالكونيوم ثلاثي فوسفات الصوديوم، وهيدروكسيد الصوديوم NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine-sodium) بتركيز NaOH نهائي 1%، وللبول والمواد السائلة الأخرى - محلول حمض الكبريتيك 3%، وللعينات الملوثة والمواد التي تحتوي على الدهون - محلول حمض الأكساليك حتى 5%. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم في بعض الحالات الإنزيمات والمواد الخافضة للتوتر السطحي (المنظفات). ويصاحب استخدام توين وبعض المنظفات الأخرى موت أقل لخلايا البكتيريا الفطرية (حيث تبقى 40-50% منها على قيد الحياة). ومع ذلك، لا يمكن استخدامها إلا للمواد السائلة. يُعد هيدروكسيد الصوديوم NALC، المُنتَج في مجموعات، الأكثر استخدامًا على نطاق واسع في العالم. تسمح هذه الطريقة بعزل أكثر من 85% من خلايا المتفطرات. يُعدّ تطهير المواد الصلبة المحتوية على الأنسجة أكثر صعوبة، إذ يصعب تقدير درجة انتشار المادة أثناء التجانس. على سبيل المثال، غالبًا ما يصاحب معالجة خزعات العقد الليمفاوية زيادة في معدل التلوث بالبكتيريا الغريبة. في هذه الحالة، يمكن استخدام 1% إيتونيوم.

تُجَنَّن المواد غير المتجانسة باستخدام حبيبات زجاجية مع وجود مُزيلات للملوثات. تُطرد المواد السائلة مركزيًا مسبقًا، وتُعالَج الرواسب فقط.

تقنية البذر والحضانة

بعد المعالجة الأولية، تُطرد المادة بالطرد المركزي، مما يُرسِّب البكتيريا الفطرية ويزيد من محتواها في الرواسب ("إثراء الرواسب"). تُحايد الرواسب الناتجة وتُلقَّح على سطح وسط غذائي كثيف أو أنابيب اختبار تحتوي على وسط سائل (شبه سائل). تُحضَّر عينات للفحص المجهري من الرواسب المتبقية. يجب أن تمنع تقنية البذر التلوث المتبادل للمادة التشخيصية.

من أجل تفسير سريري موثوق لنتائج البحوث الميكروبيولوجية، يجب مراعاة القاعدة التالية: يجب إجراء الدراسات المجهرية والثقافية بالتوازي من نفس عينة المواد التشخيصية.

تُوضع الأنابيب المُلقحة في منظم حرارة عند درجة حرارة 37 ^درجة مئوية لمدة يومين في وضع أفقي. يضمن هذا امتصاصًا أكثر انتظامًا للمادة في الوسط المغذي. بعد يومين، تُنقل الأنابيب إلى وضع رأسي وتُغلق بإحكام بسدادات مطاطية أو سيليكونية لمنع جفاف الوسط الملقح.

تُحفظ المحاصيل في منظم حرارة عند درجة حرارة 37 ^درجة مئوية لمدة 10-12 أسبوعًا مع فحص أسبوعي منتظم. تُسجل المعلمات التالية في كل فحص تحكم:

• فترة النمو المرئية من يوم البذر؛
• معدل النمو (عدد وحدات تشكيل المستعمرات)؛
• تلوث الثقافة بالنباتات الميكروبية أو الفطريات الأجنبية (يتم إزالة أنابيب الاختبار هذه)؛
• لا يوجد نمو واضح. تُترك الأنابيب في الترموستات حتى الفحص التالي.

الوسائط الغذائية

تُستخدم أوساط غذائية متنوعة لزراعة البكتيريا الفطرية: صلبة، شبه سائلة، وسائلة. ومع ذلك، لا يمتلك أيٌّ من الأوساط الغذائية المعروفة خصائص تضمن نمو جميع خلايا البكتيريا الفطرية. في هذا الصدد، ولتحسين الكفاءة، يُنصح باستخدام ٢-٣ أوساط غذائية مختلفة التركيب في آنٍ واحد.

توصي منظمة الصحة العالمية (WHO) باستخدام وسط لوينشتاين-جينسن، كوسط قياسي للعزل الأولي لمُمْرِض السل وتحديد حساسيته للأدوية. وهو وسط بيض كثيف، تنمو عليه المتفطرات في اليوم العشرين والخامس والعشرين بعد زراعة مادة إيجابية للبكتيريا. أما زراعة مادة سلبية للبكتيريا فتتطلب فترة حضانة أطول (تصل إلى 10-12 أسبوعًا).

في بلدنا، انتشر على نطاق واسع وسط بيض Finn-II الذي اقترحته شركة ER Finn. يتميز هذا الوسط باستخدامه غلوتامات الصوديوم، بدلاً من L-asparagine، مما يُحفّز مسارات أخرى لتخليق الأحماض الأمينية في المتفطرات. يبدأ النمو في هذا الوسط مبكرًا بعض الشيء، وتزداد نسبة عزل المتفطرات بنسبة 6-8% مقارنةً بوسط Lowenstein-Jensen.

لزيادة كفاءة التشخيص البكتريولوجي لمرض السل خارج الرئة، يُنصح بإضافة أوساط Finn-II المُعدّلة إلى مُركّب الأوساط الغذائية. ولتسريع النمو، يُضاف ثيوجليكولات الصوديوم بتركيز 0.05% إلى وسط Finn-II الغذائي، مما يُقلّل تركيز الأكسجين. ولحماية الأنظمة الإنزيمية للبكتيريا من النواتج السامة لأكسدة الدهون، يُضاف أسيتات ألفا توكوفيرول المضاد للأكسدة إلى وسط Finn-II الغذائي بتركيز 0.001 ميكروغرام/مل. تُزرع المادة التشخيصية بالطريقة القياسية.

في مختبرات مكافحة السل في روسيا، يتم أيضًا استخدام تعديلات أخرى للوسائط الغذائية الكثيفة: الوسط الغذائي "نوفايا" الذي اقترحه جي جي موردوفسكي، والوسط الغذائي A-6 وA-9 الذي طوره في إيه أنيكين، إلخ.

نظرًا لحقيقة أنه أثناء العلاج الكيميائي، يحدث ضرر لمختلف الأنظمة الأيضية للخلية الميكروبية، يفقد جزء من تعداد البكتيريا الفطرية القدرة على التطور بشكل طبيعي على الوسائط الغذائية التقليدية ويتطلب وسائط غذائية متوازنة تناضحيًا (شبه سائلة أو سائلة).

تقييم وتسجيل نتائج ثقافة المواد التشخيصية

بعض سلالات وأنواع البكتيريا الفطرية تنمو ببطء، وقد يظهر نموها حتى اليوم التسعين. عدد هذه الثقافات قليل، لكن هذا يُجبر على حفظ البذور في منظم حرارة لمدة شهرين ونصف إلى ثلاثة أشهر.

تنمو عادةً مستعمرات المتفطرة السلية الضارّة على أوساط بيض صلبة كمستعمرات ذات شكل حرف R، متفاوتة الحجم والمظهر. تكون هذه المستعمرات جافة، مجعدة، عاجية اللون، وذات تصبغ خفيف. أما على أوساط أخرى، فقد تكون مستعمرات المتفطرة السلية أكثر رطوبة. بعد دورة علاج كيميائي أو أثناء العلاج، يمكن عزل مستعمرات ناعمة ذات نمو رطب (شكل حرف S).

عند عزل الثقافات، يتم استخدام مجموعة من الدراسات الخاصة للتمييز بين بكتيريا السل والبكتيريا غير السلية والفطريات المقاومة للأحماض.

تُعطى نتيجة إيجابية بعد فحص مجهري إلزامي لمسحة من المستعمرات النامية المصبوغة وفقًا لـ Ziehl-Neelsen. في حالة نمو المتفطرات، تُلاحظ قضبان حمراء زاهية في المسحات، منفردة أو في مجموعات، مُشكلةً عناقيد على شكل لباد أو ضفائر. في المزارع الصغيرة، وخاصةً تلك المعزولة من مرضى عولجوا كيميائيًا لفترة طويلة، تتميز المتفطرات بتعدد أشكال واضح، يصل إلى وجود متغيرات قصيرة، شبه كروية أو مستطيلة، تُشبه فطريات الفطريات، إلى جانب أشكال قضيبية الشكل.

يتم تحديد شدة نمو البكتيريا الفطرية وفقًا للمخطط التالي: (+) - 1-20 وحدة تشكيل مستعمرة في أنبوب اختبار (إفراز بكتيري منخفض)؛ (++) - 20-100 وحدة تشكيل مستعمرة في أنبوب اختبار (إفراز بكتيري متوسط)؛ (+++) - >100 وحدة تشكيل مستعمرة في أنبوب اختبار (إفراز بكتيري غزير). في التشخيص المختبري لمرض السل، لا يكفي إعطاء إجابة تشير إلى ما إذا تم اكتشاف البكتيريا الفطرية بطريقة معينة أم لا. من الضروري أيضًا الحصول على فكرة مفصلة عن حجم وطبيعة البكتيريا الفطرية وتكوينها وخصائصها. هذه البيانات هي التي تسمح بتفسير حالة العملية بشكل صحيح، وتخطيط الاستراتيجيات، وتعديل العلاج في الوقت المناسب.

في السنوات الأخيرة، طُرِحَت أوساط غذائية قائمة على الآجار، مع إضافات نمو متنوعة، واستخدام خليط غازي خاص، لتسريع نمو البكتيريا الفطرية. ولتحفيز نمو البكتيريا الفطرية على هذه الأوساط، يُهيأ جوّ غني بثاني أكسيد الكربون (4-7%) أثناء الزراعة. ولهذا الغرض، تُستخدم حاضنات خاصة بثاني أكسيد الكربون _. ومع ذلك، شهدت أنظمة زراعة البكتيريا الفطرية الآلية تطورًا كبيرًا: MGIT-BACTEC-960 وMB/Bact.

أحد هذه الأنظمة هو نظام MGIT (أنبوب مؤشر نمو المتفطرات)، وهو تطور تكنولوجي عالي التقنية، مصمم لتسريع التشخيص البكتريولوجي لمرض السل، وتحديد حساسية المتفطرات لأدوية الخط الأول وبعض أدوية الخط الثاني. صُمم MGIT للاستخدام كجزء من جهاز VASTEC-960. تُزرع الكائنات الدقيقة في أنابيب اختبار خاصة مع وسط مغذٍّ سائل قائم على وسط Middlebrook-7H9 مُعدّل. لتحفيز نمو المتفطرات وتثبيط نمو البكتيريا الغريبة، يُستخدم مُكمل نمو MGIT ومزيج من مضادات البكتيريا PANTA.

يُسجَّل نمو الكائنات الدقيقة بصريًا. يعتمد هذا على الفلورسنت، الذي يحدث عندما تستهلك المتفطرات الأكسجين أثناء نموها. تُوضَع صبغة فلوروكروم تعتمد على الأكسجين في قاع أنبوب اختبار خاص، ومغطاة بطبقة من السيليكون. يؤدي تكاثر المتفطرات إلى انخفاض كمية الأكسجين في أنبوب الاختبار وانخفاض تركيزه، مما يؤدي إلى زيادة الفلورسنت، الذي يصبح مرئيًا عند تعريض أنبوب الاختبار للأشعة فوق البنفسجية، ويتم تسجيله تلقائيًا بواسطة مستشعرات ضوئية مدمجة في جهاز VASTES-960. تُسجَّل شدة التألق بوحدات النمو (GU). تُدخَل بيانات النمو تلقائيًا في جهاز حاسوب، حيث يمكن حفظها. يُتيح التحليل الحاسوبي لمنحنيات النمو معلومات حول وجود مجموعات مختلفة من المتفطرات، بما في ذلك غير السلية، كما يُساعد في تقييم خصائص نمو المتفطرات.

نتيجةً لاستخدام هذه الأنظمة، انخفض زمن نمو المتفطرات بشكل ملحوظ، حيث بلغ متوسطه 11 يومًا على VASTEC-960 و19 يومًا على MB/Bact، مقارنةً بـ 33 يومًا على وسط غذائي كثيف قياسي. تجدر الإشارة إلى أن هذه الأنظمة تتطلب كوادر مؤهلة تأهيلاً عالياً. يُشترط أن يكون زرع المادة على وسط سائل مصحوبًا بالزرع على وسط Lowenstein-Jensen، الذي يلعب دور الوسيط الاحتياطي في الحالات التي لا تنمو فيها متفطرات السل على أوساط أخرى.

[ 38 ]، [ 39 ]، [ 40 ]، [ 41 ]، [ 42 ]، [ 43 ]

تحديد حساسية البكتيريا للأدوية

يُعد تحديد طيف ودرجة حساسية المتفطرات لأدوية السل أمرًا بالغ الأهمية سريريًا، وكذلك للتقييم الوبائي لانتشار السل المقاوم للأدوية. علاوة على ذلك، يُتيح رصد مقاومة الأدوية تقييم فعالية برنامج مكافحة السل ككل، كونه مؤشرًا أساسيًا على فعالية جميع مكونات إجراءات مكافحة السل.

وتيرة وتوقيت اختبار حساسية الدواء:

• قبل البدء بالعلاج، مرة واحدة لتحديد استراتيجية العلاج وتكتيكاته:
• عند عزل الثقافات من مواد مختلفة من المريض (البلغم، سائل القصبة الهوائية، البول، الإفرازات، السائل النخاعي، إلخ)، يتم فحص جميع السلالات المعزولة:
• في نهاية المرحلة المكثفة من العلاج في غياب الديناميكيات السريرية والإشعاعية:
• إذا كان من الضروري تغيير نظام العلاج في حالة:
  • عدم وجود سلبية البلغم؛
  • إعادة الزراعة بعد سلبية البلغم؛
  • زيادة حادة في كمية البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية (AFB) في اللطاخة بعد انخفاضها الأولي. من المعروف أن سلالات المتفطرة السلية ذات الحساسية الدوائية المختلفة تُعزل من مواد مأخوذة من مريض مصاب بالسل. قد تختلف حساسية السلالات لأدوية السل من حيث طيف الأدوية ودرجة المقاومة وتكرارها وسرعة تطورها.

يتم تحديد درجة مقاومة الأدوية لبكتيريا السل وفقًا للمعايير المعمول بها، والتي تركز على الأهمية السريرية للمقاومة وتعتمد على نشاط الدواء المضاد للسل، وحركته الدوائية، وتركيزه في الآفة، والجرعة العلاجية القصوى، وما إلى ذلك.

يتم حاليًا تحديد حساسية البكتيريا للأدوية باستخدام الطرق الميكروبيولوجية:

• التركيزات المطلقة (طريقة التخفيف على وسائط المغذيات الصلبة أو السائلة)،
• النسب،
• معامل المقاومة.

عادةً ما تتجلى المقاومة في نمو مستعمرات بكتيريا السل الملحوظة بصريًا. ومع ذلك، توجد طرق تُحفّز النمو في المراحل المبكرة من انقسام خلايا البكتيريا الفطرية من خلال تفاعلات لونية. تُقلّل هذه الطرق مدة الاختبار من 3-4 أسابيع إلى أسبوعين.

انتشرت في روسيا طريقة التركيز المطلق التي أوصت بها لجنة العلاج الكيميائي التابعة لمنظمة الصحة العالمية كطريقة موحدة. تُعد هذه الطريقة الأبسط من الناحية المنهجية، لكنها تتطلب توحيدًا ودقةً كبيرين في الإجراءات المخبرية. يتكون اختبار حساسية الدواء من مجموعة من أنابيب الاختبار تحتوي على وسط مغذٍّ مُعدّل بأدوية مضادة للسل. تتكون المجموعة من أنبوبين أو ثلاثة أنابيب اختبار بتركيزات مختلفة من كل دواء مُستخدم، وأنبوب اختبار واحد للتحكم يحتوي على وسط خالٍ من الدواء، وأنبوب اختبار واحد يحتوي على 1000 ميكروغرام/مل من ساليسيلات الصوديوم أو 500 ميكروغرام/مل من حمض البارانيتروبينزويك للكشف عن نمو المتفطرات غير السلية.

لتحضير مجموعة من الوسائط مع المستحضرات، يُستخدم وسط لوينشتاين-جينسن مُعدّل (خالٍ من النشا)، ويُسكب في قوارير. يُضاف إلى كل قارورة مقدار مُعين من التخفيف المُناسب من دواء السل. تُخلط محتويات القوارير جيدًا، وتُسكب في أنابيب اختبار، وتُخثر في وضع مائل لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة 85 درجة مئوية. يُنصح بتخثر الوسط في جهاز تخثر كهربائي مُزوّد بتحكم تلقائي في درجة الحرارة. وسط يحتوي على أدوية السل.

يمكن تخزين الصف الأول في الثلاجة عند درجة حرارة تتراوح بين ٢ و٤ درجات مئوية لمدة شهر واحد، أما الصف الثاني من الأدوية، فلا تزيد مدته عن أسبوعين. يُمنع تخزين الوسائط التي تحتوي على الأدوية في درجة حرارة الغرفة. عند تحضير محاليل أدوية السل، يُؤخذ نشاطها في الاعتبار، ويُحسب التركيز مع تعديل الوزن الجزيئي للجزء غير النوعي من الدواء، ودرجة نقائه، وما إلى ذلك. لتحديد حساسية الدواء، تُستخدم مواد نقية كيميائيًا فقط.

مبدأ هذه الطريقة هو تحديد تركيز دواء مضاد للسل يُثبط نمو جزء كبير من مجموعة البكتيريا المتفطرة. عند تطبيقها بشكل صحيح، تتمتع هذه الطريقة بموثوقية عالية.

قبل إجراء الاختبار، من الضروري التأكد من أن المزرعة المعزولة لبكتيريا السل لا تحتوي على ميكروفلورا دخيلة. يتم تحضير معلق متجانس يحتوي على 500 مليون جسم ميكروبي في 1 مل (معيار العكارة البصرية 5 وحدات) من مزرعة البكتيريا في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪. يتم تخفيف المعلق الناتج بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ (1:10) ويضاف 0.2 مل من المعلق إلى كل أنبوب اختبار من مجموعة الوسائط الغذائية. توضع أنابيب الاختبار الملقحة في منظم حرارة عند 37 درجة مئوية وتحفظ أفقيًا لمدة 2-3 أيام بحيث يتم تلقيح السطح المائل للوسط الغذائي بالتساوي بمعلق بكتيريا السل. ثم يتم نقل أنابيب الاختبار إلى وضع رأسي وحضنها لمدة 3-4 أسابيع. يتم تسجيل النتائج بعد 3-4 أسابيع.

بما أن عزل العامل الممرض من المادة السريرية على أوساط التغذية يستغرق شهرًا إلى شهر ونصف على الأقل، فإن نتائج تحديد حساسية الدواء باستخدام هذه الطريقة لا يمكن الحصول عليها قبل شهرين إلى شهرين ونصف من غرس المادة. وهذا أحد أهم عيوب هذه الطريقة.

تُفسَّر نتائج اختبار حساسية الأدوية الفطرية بناءً على معايير محددة. على الأوساط الصلبة، تُعتبر المزرعة حساسة لتركيز الدواء الموجود فيها إذا لم يتجاوز عدد مستعمرات البكتيريا الفطرية المزروعة في أنبوب اختبار مُعيّن مع الدواء 20 مستعمرة، مع نمو وفير في أنبوب اختبار مرجعي بدون أدوية. فقط إذا تجاوز عدد المستعمرات 20 مستعمرة، تُعتبر المزرعة مقاومة لتركيز مُعيّن. عمليًا، عند الحصول على نتائج نمو في أنابيب اختبار تُقارب 20 وحدة تشكيل مستعمرة، من الضروري إخطار الوحدة السريرية بأن الحساسية أو المقاومة في هذه الحالة تكون على حافة الخطر، لأن هذا قد يُفسر أحيانًا عدم وضوح ديناميكيات المؤشرات السريرية.

في مختلف المستحضرات، يُحدَّد تركيز معين يُلاحظ عنده تكاثر نسبة حرجة من البكتيريا الفطرية. تُسمى هذه التركيزات "حرجة". ويُعتمد على حجم نمو البكتيريا الفطرية على وسط غذائي يحتوي على تركيز حرج كمعيار لاستقرار المستحضر.

في الممارسة الطبية المحلية، عند تحديد مقاومة الأدوية، لا يقتصر تحديد التركيزات الحرجة فقط على تحديدها. ويعود ذلك إلى أن التعريف الموسع لمستوى مقاومة العامل الممرض للأدوية يُمكّن الطبيب من صياغة استراتيجيات العلاج الكيميائي بدقة أكبر، بالاعتماد على معرفته بالتأثير المُعزز لتركيبات الأدوية، وتوقع المقاومة المتبادلة، أو استخدام أدوية أكثر فعالية من مجموعة أدوية السل المستخدمة.

طريقة التركيز المطلق هي الأبسط، ولكنها أيضًا الأكثر حساسيةً للأخطاء في تطبيقها. أما طريقة النسبة، فهي الأكثر موثوقيةً، خاصةً عند تحديد الحساسية لأدوية الخط الثاني، وهي شائعة الاستخدام خارج روسيا. فهي تأخذ في الاعتبار عيوب طريقة التركيز المطلق، إلا أن تطبيقها يتطلب جهدًا أكبر.

الطريقة مشابهة جدًا لطريقة التركيز المطلق. تحضير أنابيب الاختبار بالأدوية هو نفسه كما هو الحال في طريقة التركيز المطلق. ومع ذلك، يتم تقليل جرعة البذور من معلق بكتيريا السل بمقدار 10 مرات، مما يزيل تكرار المقاومة التلقائية لبعض سلالات بكتيريا السل للأدوية مثل إيثامبوتول، بروثيوناميد، كابريوميسين. كضوابط، يتم استخدام 2 أو 3 أنابيب بجرعة بذور مساوية لتلك الموجودة في أنابيب الاختبار، مخففة على التوالي 10 و 100 مرة. معيار المقاومة هو نسبة النمو الملحوظ بصريًا لبكتيريا السل. بالنسبة لأدوية الخط الأول، فإن معيار المقاومة هو النمو الزائد بنسبة 1٪ من السكان الأوليين، بالنسبة لأدوية الخط الثاني - نمو 1 أو أكثر من 10٪ من السكان الأوليين، اعتمادًا على التركيز الحرج المختار.

في عام 1997، قامت مجموعة العمل التابعة لمنظمة الصحة العالمية والاتحاد الدولي لمكافحة السل والمعنية باكتشاف مقاومة الأدوية المضادة للسل بإجراء تعديلات على هذه المعايير، واقترحت اعتبار البكتيريا الفطرية التي تنمو على وسط البيض الكثيف من نوع Lowenstein-Jensen عند التركيزات التالية مقاومة:

• ديهيدروستربتومايسين - 4 ميكروجرام/مل؛
• إيزونيازيد - 0.2 ميكروغرام/مل:
• ريفامبيسين - 40 ميكروغرام/مل:
• إيثامبوتول - 2 ميكروجرام/مل.

في عام 2001، تم اقتراح تركيزات حرجة للأدوية التالية من الخط الثاني (لنسبة حرجة تبلغ 1%):

• كابريوميسين - 40 ميكروجرام/مل؛
• بروتيوناميد - 40 ميكروجرام/مل؛
• كاناميسين - 30 ميكروغرام/مل؛
• فيوميسين - 30 ميكروجرام/مل؛
• سيكلوسيرين - 40 ميكروجرام/مل؛
• حمض الأمينوساليسيليك - 0.5 ميكروجرام/مل؛
• أوفلوكساسين - 2 ميكروجرام/مل.

يتم تقييم نتائج النمو بعد 4 أسابيع كنتيجة أولية وبعد 6 أسابيع من الزراعة كنتيجة نهائية.

لتحديد حساسية الدواء للبيرازيناميد، المستخدم على نطاق واسع في العلاج الكيميائي الحديث لمرض السل، يُوصى بتركيز حرج يبلغ 200 ميكروغرام/مل. ومع ذلك، لا توجد حتى الآن طريقة مقبولة عمومًا لتحديد مقاومة الدواء لهذا الدواء على أوساط غذائية صلبة، لأن نشاطه المضاد للبكتيريا لا يظهر إلا في بيئة حمضية (درجة الحموضة <6)، وهو أمر يصعب الحفاظ عليه تقنيًا. إضافةً إلى ذلك، فإن العديد من المزارع السريرية لبكتيريا السل لا تستجيب للنمو على أوساط البيض ذات البيئة الحمضية.

لتقييم جودة نتائج تحديد حساسية المتفطرات للأدوية، يُنصح بمراقبة كل دفعة جديدة من وسط لوينشتاين-جينسن عن طريق تحديد حساسية سلالة المتحف القياسية H37Rv بالتوازي. بالإضافة إلى ذلك، هناك معايير ميكروبيولوجية معينة يجب استيفاؤها لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار وتفسيرها بشكل صحيح. تشمل هذه المعايير قابلية مزرعة متفطرات السل للنمو، وقواعد الحصول على معلق متجانس، وقواعد اختيار مزارع متفطرات السل، ومدى تمثيل الكتلة البكتيرية المختارة. تنخفض موثوقية تحديد مقاومة الأدوية مع ضعف إفراز البكتيريا بشكل كبير.

في الآونة الأخيرة، تم الاعتراف بطريقة تحديد حساسية الأدوية باستخدام الأنظمة الآلية كطريقة واعدة. وأكثرها تقدمًا في هذا المجال هي التطورات القائمة على جهاز VASTEC MGIT-960. في هذه الحالة، يتم تحديد حساسية بكتيريا السل للأدوية بناءً على طريقة النسبة المعدلة. أثناء التحديد، تتم مقارنة معدل نمو بكتيريا السل في أنبوب التحكم وفي الأنابيب التي تحتوي على الأدوية. لتحديد الحساسية للستربتومايسين، والإيزونيازيد، والريفامبيسين، والإيثامبوتول، تُستخدم إضافات التخصيب والمضادات الحيوية المضمنة في مجموعة SIRE. لتحديد الحساسية للبيرازيناميد، تُستخدم مجموعة PZA. أثناء الاختبار، يتم تطعيم أنابيب الاختبار التي تحتوي على الأدوية بمعلق من بكتيريا السل، بالإضافة إلى أنابيب التحكم المخففة بمقدار 100 ضعف من المعلق لجميع الأدوية، باستثناء البيرازيناميد، حيث يكون تخفيف المعلق 10 مرات. معيار الاستقرار هو مؤشر نمو البكتيريا الفطرية البالغ ١٠٠ وحدة دولية (GU) عند وصول النمو في أنبوب التحكم إلى ٤٠٠ وحدة دولية (GU) (انظر "طرق زراعة عزل البكتيريا الفطرية"). تُسجل النتائج وتُفسر تلقائيًا، ويُضبط البرنامج المُدخل أو المُختار.

تُستخدم التركيزات النهائية في أنبوب الاختبار مع وسط المغذيات السائل كتركيزات حرجة. حاليًا، طُوّرت تركيزات حرجة لكلٍّ من أدوية الخط الأول وبعض أدوية الخط الثاني. تجدر الإشارة إلى أن تحديد حساسية بكتيريا السل للسيكلوسرين وحمض الأمينوساليسيليك يُجرى فقط على وسط مغذيات البيض.

يتيح بروتوكول مُفصّل للعمل مع النظام الموصوف اختبار حساسية الدواء، سواءً على مزرعة معزولة (بوسط غذائي كثيف)، أو باستخدام النمو الأولي للبكتيريا المتفطرة في أنبوب اختبار MGIT. يُقلّل هذا الخيار الأخير بشكل كبير من الوقت اللازم لإجراء الدراسات الزراعية، مما يسمح بالحصول على نتائج كاملة لزراعة بكتيريا السل المتفطرة (بما في ذلك معلومات عن حساسية الدواء) في غضون 3 أسابيع من جمع المادة، بينما لا تُوفّر الطريقة التقليدية هذه النتائج إلا في الشهر الثالث. إن الحصول على نتائج سريعة، عندما يكون المريض في مرحلة العلاج المكثف، يُعوّض التكلفة العالية نسبيًا للدراسات.

[ 44 ]، [ 45 ]، [ 46 ]، [ 47 ]، [ 48 ]، [ 49 ]، [ 50 ]

التمييز بين المتفطرات

نظراً لأن الأوساط الغذائية المستخدمة ليست انتقائية تماماً، يُعتبر التمييز اللاحق بين المتفطرات المعزولة أمراً ضرورياً. وتعود ضرورة التمييز بين المتفطرات إلى عدد من سمات العمليات المرضية التي يسببها ممثلو هذا الجنس، مثل اختلاف مسار ونتيجة مرض السل وداء المتفطرات، ووجود مقاومة طبيعية لبعض أدوية السل.

من المعروف أن التعرف الأولي على بكتيريا معقد السل من بكتيريا غير السل يتم وفقًا للخصائص التالية: معدل النمو على بيئات غذائية كثيفة، وتكوين الصبغة، وشكل المستعمرة، ووجود مقاومة للأحماض ودرجة الحرارة المثلى للنمو.

لسوء الحظ، لا توجد طريقة مخبرية واحدة يمكنها التمييز بشكل موثوق بين المتفطرات السلية المعقدة والميكوبكتيريا المقاومة للأحماض الأخرى؛ ومع ذلك، فإن الجمع بين العلامات الموصوفة أعلاه ونتائج عدد من الاختبارات الكيميائية الحيوية الموضحة أدناه يسمح بتحديد المتفطرات السلية المعقدة باحتمالية تصل إلى 95٪.

للتفريق بين المتفطرات المعقدة من السل (M. tuberculosis، M. bovis، M. bovisBCG، M. africanum، M. microti، M. canettii وغيرها) من المتفطرات غير السلية التي تنمو ببطء، يتم استخدام الاختبارات الكيميائية الحيوية الأساسية للكشف عن وجود العلامات التالية:

• القدرة على إنتاج حمض النيكوتينيك (اختبار النياسين):
• نشاط اختزال النترات؛
• الكاتالاز الثابت بالحرارة؛
• النمو على وسط يحتوي على ساليسيلات الصوديوم (1 ملغ/مل).

كاختبار إضافي، يمكن أيضًا استخدام اختبارات النمو على وسط يحتوي على 500 ميكروجرام/مل من حمض البارا نيتروبنزويك أو 5% كلوريد الصوديوم.

تتمكن العديد من المختبرات البكتريولوجية من تحديد هذه الكائنات الحية الدقيقة فقط على المستوى المعقد، وذلك بسبب القدرات المحدودة للمختبرات والقدرات المنهجية للمتخصصين.

في معظم الحالات العملية، تكفي الاختبارات التالية للتمييز بين المتفطرة السلية والمتفطرة البقرية: النياسين، واختزال النترات، والبيرازيناميداز، وتسجيل النمو على وسط يحتوي على 2 ميكروغرام/مل من هيدرازيد حمض الثيوفين-2-كربوكسيليك. يُؤخذ في الاعتبار أن المتفطرات السلية المعقدة تتميز بمجموعة السمات التالية:

• النمو البطيء (أكثر من 3 أسابيع)؛
• درجة حرارة النمو في حدود 35-37 ^درجة مئوية؛
• غياب التصبغ (اللون العاجي)؛
• تلوين واضح مقاوم للأحماض؛
• اختبار النياسين الإيجابي؛
• اختبار اختزال النترات الإيجابي؛
• غياب الكاتالاز الثابت حراريا (68 ^درجة مئوية).
• نقص النمو على وسط Lowenstein-Jensen المحتوي على:
  • 1000 ميكروغرام/مل حمض الساليسيليك الصوديوم،
  • 500 ميكروغرام/مل حمض البارا نيتروبنزويك،
  • 5% كلوريد الصوديوم:
• النمو في وجود 1-5 ميكروجرام/مل من حمض الثيوفين-2-كربوكسيليك.

ستزداد أهمية تمييز المتفطرات المعزولة بشكل ملحوظ مع تزايد وتيرة تسجيل حالات الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز المرتبطة بالسل أو داء المتفطرات. في الوقت الحالي، لا يوجد يقين مطلق بشأن جاهزية المختبرات الإقليمية العملية لأداء هذا الكم من العمل على النحو الأمثل.

[ 51 ]، [ 52 ]، [ 53 ]، [ 54 ]، [ 55 ]، [ 56 ]، [ 57 ]، [ 58 ]

التشخيص المناعي لمرض السل

هناك عدد من الظواهر والمستحضرات والاختبارات المناعية العالمية التي اكتُشفت في البداية تحديدًا في مرض السل أو في نموذج الاستجابة المناعية للمتفطرات. وتشمل هذه الظواهر لقاح BCG والسل، وظاهرة مثل اختبار DST الجلدي (اختبارات السل - تفاعلات بيركيه ومانتوكس)، ورد الفعل الناتج عن إعطاء السل تحت الجلد للحيوانات المُحسسة (ظاهرة كوخ). كما اكتُشفت بعض الأجسام المضادة الأولى للأمراض المُعدية في مرض السل. وبطبيعة الحال، كلما تعمق فهم آليات المناعة المضادة للسل والتحكم الجيني بها، اتسع نطاق استخدام الأساليب والمستحضرات المناعية المؤثرة على المناعة في حل المشكلات العملية في علم السل.

تُعتبر أهم وأعقد مشكلة عملية في الوقت الحالي هي الكشف عن مرض السل في عملية الفحص الشامل للسكان. ومع ذلك، ورغم التقارير العديدة عن "النجاحات" (على مواد محدودة)، لا توجد طريقة مناعية (يمكن تكرارها بأيدي أي شخص) أو دواء مناسب لهذه الأغراض.

تُستخدم الطرق المناعية، وخاصة الدراسات المصليّة (تحديد المستضدات والأجسام المضادة) واختبارات استفزاز السل، على نطاق واسع في الممارسة السريرية.

تحتل الطرق المصليّة، التي تحدد المستضدات والأجسام المضادة في بيئات مختلفة من الجسم، المرتبة الأولى بين الدراسات المناعية المستخدمة في التشخيص التفريقي.

تعتمد دقة تحديد الأجسام المضادة لبكتيريا السل على المستضدات المستخدمة في التحليل المناعي. وقد تم اقتراح عدد كبير من المستضدات، أولها التوبركولين PPD.

• PPD ومستحضرات معقدة أخرى من سائل الثقافة؛
• تفكيك بالموجات فوق الصوتية؛
• مستخلص تريتون ومستحضرات جدار الخلية المعقدة الأخرى؛
• 5- مستضد (دانيال)؛
• 60- مستضد (كوكسيتو)؛
• ليبوأرابينومانان؛
• عامل الحبل (تريهالوز-6،6-داي-مايكولات)؛
• الفينولية وغيرها من الجليكوليبيدات؛
• الليبوبوليساكاريد؛
• مستضد رابط الفيبرونيكتين؛
• البروتينات (غالبًا ما تكون معادة التركيب)؛ 81،65،38،34،30،19،18،16،15.12 كيلو دالتون، إلخ.

نتيجةً لسنواتٍ طويلة من البحث الذي أجراه علماء روس وأجانب، تم تحديد الأنماط الرئيسية لتكوين الأجسام المضادة وفعالية التشخيص المصلي لمرض السل: كلما زاد تعقيد المستضد، زادت حساسية الاختبارات وانخفضت خصوصيتها. وتختلف الخصوصية باختلاف البلدان تبعًا لإصابة السكان بالمتفطرة السلية والبكتيريا غير السلية، وتطعيم BCG، وما إلى ذلك. لدى الأطفال، تكون معلومات التشخيص المصلي أقل منها لدى البالغين. في حالات السل الأولية (غالبًا لدى الأطفال)، يكون تحديد IgM أكثر معلوماتية؛ وفي حالات السل الثانوية - IgG. لدى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، تكون معلومات التشخيص المصلي في تحديد الأجسام المضادة أقل. تعتمد فعالية تحديد الأجسام المضادة على عدد من "اللحظات السريرية": نشاط العملية (وجود أو عدم وجود "عزل" للبكتيريا الفطرية، وجود تجاويف الاضمحلال، درجة التسلل)، انتشار العملية، مدة مسارها.

تبلغ حساسية طريقة الفحص المناعي الإنزيمي (EIA) حوالي 70%. ويعود ضعف فعالية الدراسة إلى انخفاض خصوصيتها. في السابق، كانت إمكانيات استخدام الفحص المصلي في الفئات المعرضة للخطر، وخاصةً لدى الأشخاص الذين يعانون من تغيرات رئوية بعد السل.

لزيادة دقة اختبار ELISA، يتم البحث عن مستضدات أكثر دقة، بما في ذلك تلك التي يتم الحصول عليها عن طريق الهندسة الوراثية: ESAT-6، إلخ (انظر أعلاه). إن استخدام مستضدات محددة بدقة (38 كيلو دالتون، ESAT) يزيد من الدقة، ولكنه يقلل بشكل كبير من حساسية التحليل. إلى جانب اختبار ELISA (أنظمة اختبار المختبر التجريبية، مثل مجموعة Pathozyme ELISA)، يتم أيضًا تقديم مجموعات الكروماتوغرافيا المناعية مع الترشيح الجانبي (Mycodot)، بالإضافة إلى اختبارات أخرى مماثلة (تحليل النقاط الغشائية) مع التقييم البصري لنتيجة الاختبار. عند إجراء هذه الاختبارات، يستغرق التحليل من 10 إلى 30 دقيقة؛ فهي لا تتطلب معدات خاصة، بل تتطلب تقييمًا بصريًا للنتائج، وهو ما يرتبط بذاتية معينة. تتمتع هذه الطرق بنفس خصائص الحساسية والدقة تقريبًا (70٪ و90-93٪، على التوالي) مثل اختبار ELISA التقليدي.

يُعدّ استخدام أساليب التحليل المناعي ذا قيمة خاصة كطريقة إضافية تُؤخذ في الاعتبار ضمن مجموعة الأساليب المستخدمة في التشخيص التفريقي لمرض السل، وخاصةً في تشخيص أشكاله خارج الرئة. تُعدّ طريقة ELISA الأكثر فعالية في تشخيص التهاب السحايا السلي عند فحص السائل الدماغي الشوكي. في هذه الحالة، تتراوح حساسية التحليل بين 80% و85%، وتتراوح نوعيته بين 97% و98%. وتُشير المعلومات إلى فعالية تحديد الأجسام المضادة لبكتيريا السل في السائل الدمعي في تشخيص التهاب القزحية السلي.

تحريض تخليق الإنترفيرون جاما في المختبر

إنترفيرون جاما (IFN-γ) هو عامل حماية مناعية نوعية، يتحقق بتنشيط الأنظمة الإنزيماتية للبلعميات. ويحدث تحريض تخليق إنترفيرون جاما بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية الحساسة نتيجة تفاعلها مع مستضدات البكتيريا الفطرية.

يُستخدم كلٌّ من مُستضدات التوبركولين PPD والمستضدات النوعية المُستحصل عليها بالهندسة الوراثية كمستضدات، وخاصةً مُستضد ESAT-6 (مستضد مُفرز مُبكرًا بوزن جزيئي 6 كيلو دالتون) وCFP-10 (بروتين ترشيح المزرعة، 10 كيلو دالتون). لا توجد مُستضدات مُهندَسة وراثيًا أو مُعاد تركيبها في خلايا لقاح BCG والمُتفطرات الأخرى. عند استخدام التوبركولين، تكون نتائج اختبار تحريض IFN-γ مُقارنةً بنتائج اختبار الجلد للتوبركولين (ارتباط مباشر). عند استخدام المُستضدات المُهندَسة وراثيًا، تكون نتائج الاختبار أكثر دقةً ولا تعتمد على تطعيم BCG السابق. عند فحص الأفراد المُلقَّحين الذين لم يُخالطوا عدوى السل، تكون دقة الاختبار 99%. تتراوح حساسية الاختبار بين مرضى السل من 81% إلى 89%.

طُوّرت الاختبارات والتشخيصات بناءً على زراعة قصيرة الأمد لخلايا دم كاملة أو خلايا وحيدة النواة معزولة من الدم باستخدام مستضدات بكتيريا السل في المختبر، يليها تحديد تركيز الإنترفيرون-γ أو إحصاء عدد الخلايا اللمفاوية التائية التي تُصنّعه. يُحدَّد تركيز الإنترفيرون المُصنّع في أنبوب اختبار بواسطة اختبار الإليزا (ELISA) باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة ترتبط بالإنترفيرون-γ. ثم، باستخدام معايرة الإنترفيرون-γ القياسي، يُحدَّد تركيزه في أنبوب الاختبار أو في آبار الصفيحة.

في اختبار Elispot، يتم حساب عدد الخلايا التائية التي تصنع IFN-γ على سطح طبق مطلي بأجسام مضادة لـ IFN-γ.

يزعم مطورو اختبار التشخيص المُستحثّ لإنترفيرون جاما (IFN-γ) في المختبر، والمعتمد من قِبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، أن هذا الاختبار لا يُميّز بين عدوى السل الكامنة والنشطة. لذلك، في المناطق ذات معدلات الإصابة المرتفعة، لا يُمثّل هذا الاختبار قيمة تشخيصية مباشرة. مع ذلك، يُمكن استخدامه في بلدنا للتفريق بين عدوى السل لدى الأطفال والحساسية بعد التطعيم، وكذلك لتقييم مستوى المناعة النوعية أثناء العلاج.

في الوقت الحالي، يتم دراسة نظام اختبار محلي لتحديد تحريض تخليق IFN-γ بواسطة مستضدات السل المحددة في المختبر.

الحالة المناعية ومسار مرض السل، التصحيح المناعي

أثناء علاج مرض السل، تحدث تغيرات في مستضدات الدم وحالة الجهاز المناعي لدى الأشخاص.

البيانات المتعلقة بتغيرات الإفرازات والأنسجة متناقضة إلى حد كبير. الشيء الوحيد الذي يمكن ملاحظته بشكل قاطع هو أن الأورام الحبيبية السلية، كقاعدة عامة، تحتوي على عدد كبير من الخلايا اللمفاوية التائية النشطة.

ومن المنطقي أن نتناول نقطتين أخريين ضروريتين لفهم دور الآليات المناعية في علاج مرض السل لدى البشر:

• يعاني مرضى الإيدز من ارتفاع معدل الإصابة بمقاومة الأدوية المتعددة؛
• وفي حالة مقاومة الأدوية المتعددة (وفي غياب الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية)، تكون الاضطرابات المناعية (وخاصة مناعة الخلايا التائية) ذات أهمية خاصة.

في مرض السل، يتم استخدام طرق مختلفة لتصحيح المناعة على نطاق واسع: أولاً وقبل كل شيء، هذه هي الأدوية التي تعمل بشكل رئيسي على مناعة الخلايا التائية ونظام الخلايا البلعمية أحادية النواة (هرمونات الغدة الزعترية، الأيزوفون، الليكوبيد، البوليوكسيديونيوم، إلخ)، وكذلك البكتيريا الفطرية الكاملة (المضعفة) ومكوناتها.

التشخيص البيولوجي الجزيئي لمرض السل

تشمل مناهج البيولوجيا الجزيئية في تشخيص الأمراض المعدية بشكل رئيسي أساليب تعتمد على معالجة المواد الجينومية لمسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية لتحديد مادة وراثية محددة - مقاطع من الحمض النووي تحمل تسلسل نوكليوتيدات خاص بنوع أو سلالة معينة من مسببات الأمراض، وذلك لتحليل تسلسلات محددة من الحمض النووي في الجينات التي تحدد حساسية مسببات الأمراض لأدوية معينة، وكذلك لتحليل النشاط الوظيفي لبعض جينات مسببات الأمراض. انتشرت مناهج البيولوجيا الجزيئية على نطاق واسع في البحث العلمي والتطبيق العملي في تشخيص ومراقبة مختلف أنواع العدوى البكتيرية والفيروسية بعد اكتشاف كاري موليس (الحائزة على جائزة نوبل عام ١٩٨٩) لتفاعل البوليميراز المتسلسل عام ١٩٨٥.

مبادئ وقدرات طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل

يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تضخيم (مضاعفة) تسلسل نوكليوتيد (جزء من الحمض النووي لمسببات الأمراض) في أنبوب اختبار خلال بضع ساعات ملايين المرات. ويُحدد إجراء التفاعل في وجود سلاسل الحمض النووي المفردة الحساسية العالية للغاية للتحليل.

يحدد تسلسل النوكليوتيدات في أقسام معينة من سلسلة الحمض النووي التفرد الجيني للكائن الحي الدقيق، وهو ما يفسر الخصوصية العالية لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تكمن أهمية هذه الطريقة في الكشف عن خصائص المتفطرة السلية ودراستها في الخصائص البيولوجية للكائن الحي الدقيق الذي يتميز بنمو بطيء للغاية: حيث يبلغ وقت مضاعفة الحمض النووي للمتفطرة السلية أثناء زراعتها 12-24 ساعة.

مبدأ طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل هو التضخيم - مضاعفة أجزاء من تسلسل DNA محدد في أنبوب اختبار بحجم صغير عدة ملايين من المرات مع التكرار الدوري للمراحل الثلاث التالية من التفاعل، والتي تحدث كل منها في نظام درجة حرارة مختلف:

• المرحلة الأولى - تحلل الحمض النووي مزدوج السلسلة عند التسخين مع تباعد سلاسله؛
• المرحلة الثانية - الارتباط التكميلي (التهجين) للبادئات (النيوكليوتيدات التمهيدية) مع الأقسام النهائية لسلاسل جزء DNA محدد بدقة تم اختياره للتضخيم؛
• المرحلة الثالثة - إكمال سلسلة شظايا الحمض النووي باستخدام بوليميراز الحمض النووي الثابت حرارياً.

للتضخيم، يجب أن يحتوي أنبوب الاختبار على جزيئات من مصفوفة الحمض النووي. أربعة أنواع من ثلاثي فوسفات الديوكسينوكليوسيد (نيوكليوتيدات) تحتوي على القواعد النيتروجينية المقابلة: الأدينين (A)، الثايمين (T)، الجوانين (G)، السيتوزين (C)؛ أوليجونوكليوتيدات تمهيدية مصنّعة صناعيًا (بادئات) تتكون من 18-20 زوجًا من القواعد؛ إنزيم بوليميراز الحمض النووي (DNA) المستقر حراريًا، بدرجة حرارة مثالية تتراوح بين 68 و72 ^درجة مئوية، وأيونات المغنيسيوم.

تعتمد خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على اختيار قطعة الحمض النووي. وبناءً عليه، تُصنع أوليجونوكليوتيدات البادئ المرافقة. وتُحدد خصوصية التهجين وإكمال سلسلة الحمض النووي بمبدأ تكامل أزواج القواعد النيتروجينية التالية: الأدينين-الثايمين، الجوانين-السيتوزين.

لتحديد جينوم فطريات السل المعقدة، يُعدّ جزء الحمض النووي IS6110 هدف التضخيم الأكثر فعالية في معظم أنظمة الاختبار، حيث يحتوي في معظم سلالات فطريات السل على عدد كبير (10-20) من التكرارات في الجينوم، مما يضمن، إلى جانب الدقة، حساسية عالية للتحليل. في الوقت نفسه، وُصفت سلالات فطريات السل ذات عدد قليل من التكرارات أو خالية من جزء IS6110.

استخراج جزيئات الحمض النووي من عينة بيولوجية

لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، يجب عزل جزيئات الحمض النووي للممرض من المادة البيولوجية في حجم ضئيل، مع كمية ضئيلة من الحمض النووي غير المحدد ومختلف مثبطات الإنزيم - بوليميراز الحمض النووي.

يجب تحضير العينات في ظروف تمنع التلوث المتبادل للعينات المدروسة بجزيئات الحمض النووي المعزولة. يتطلب ذلك معالجة أولية للغرفة بالأشعة فوق البنفسجية، وأرضياتها وأسطح عملها، بما في ذلك الطاولات والأجهزة، بمحاليل تحتوي على الكلور. كما يلزم استخدام قفازات نظيفة، وأنابيب اختبار للاستخدام مرة واحدة، وأطراف ماصات آلية.

لعزل الحمض النووي لبكتيريا السل من العينات السريرية (السائل النخاعي، غسيل الشعب الهوائية) التي لا تحتوي على عدد كبير من الكريات البيض أو الحطام الخلوي أو الأملاح، يكفي طرد العينة بسرعة 3-4 آلاف دورة في الدقيقة، وإضافة 20-30 ميكرولتر من محلول 2٪ من Triton X-100 إلى الرواسب وتسخينها عند 90 ^درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

يتطلب تحضير عينة البلغم تسييلًا فعالًا، عادةً باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 4% وN-أسيتيل-L-سيستين (NALC) بتركيز 50-80 ملغ لكل عينة، حسب لزوجتها. يجب تحضير محلول NALC فورًا، أو يمكن إضافة مسحوق NALC جافًا مباشرةً إلى العينة. بعد التسييل، تُطرد العينات مركزيًا لمدة 15 دقيقة بسرعة 3500-4000 دورة في الدقيقة (3000 غرام) في أنابيب ذات أغطية لولبية سعة 50 مل، أي في نفس الظروف الموصى بها لتحضير البلغم قبل الزراعة.

لاستخراج الحمض النووي من الرواسب، تُستخدم غالبًا طريقة تعتمد على استخدام محلول إيزوثيوسيانات غوانيدين بتركيز 5-6 مولار كعامل تحليل، بالإضافة إلى جسيمات أكسيد السيليكون الدقيقة المسامية ("تراب الدياتومي") التي تمتص جزيئات الحمض النووي. تُغسل بعد ذلك المواد غير النوعية، بما في ذلك المثبطات المحتملة، في محلول إيزوثيوسيانات غوانيدين بتركيز 2.5 مولار ومحلول إيثانول، وبعد ذلك تُمتص جزيئات الحمض النووي في الماء، وتُستخدم هذه العينات لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لتبسيط تقنية استخراج الحمض النووي، غالبًا ما يُستبدل "تراب الدياتومي" بجسيمات دقيقة مغناطيسية مطلية بأكسيد السيليكون. في هذه الحالة، يُستخدم حامل مغناطيسي خاص للأنابيب الدقيقة لترسيب الجسيمات بدلاً من الطرد المركزي.

طُوّرت في روسيا طريقة مبتكرة للفصل المناعي المغناطيسي للبكتيريا الفطرية، مع استخلاص الحمض النووي للممرض لاحقًا. للفصل المناعي المغناطيسي لبكتيريا السل، تُستخدم جسيمات حديدية بأحجام 3-5 ميكرومتر، مغلفة بأكسيد السيليكون، ترتبط بها أجسام مضادة متعددة النسائل (أرنب) لبكتيريا السل الفطرية بواسطة رابطة كيميائية. بعد التحلل القلوي، تُحايد عينات البلغم بمحلول حمضي من نوع Tris-HCl، وتُحضّن بمادة ماصة مناعية مغناطيسية. ثم تُجمع الجسيمات الحديدية المناعية باستخدام قضيب مغناطيسي ذي طرف قابل للاستبدال، وتُنقل إلى أنبوب دقيق، وتُرسّب. يُضاف 20-30 ميكرولترًا من محلول Triton X-100 بتركيز 2%، ويُسخّن لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 90 ^درجة مئوية. يُستخدم السائل العلوي كمصفوفة للحمض النووي لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

من المشكلات الصعبة استخلاص الحمض النووي لبكتيريا السل من عينات الخزعة. لتحليل الخزعة، يُستخدم إنزيم البروتيناز K بتركيز نهائي يتراوح بين 200 و500 ملغم/لتر عند درجة حرارة 56 ^درجة مئوية طوال الليل. ثم يُستخرج باستخدام إحدى الطرق المعروفة. غالبًا ما يُؤدي وجود كمية زائدة من الحمض النووي غير النوعي في تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لعينات الخزعة إلى تثبيط التفاعل، مما يتطلب تكرار استخلاص الحمض النووي.

طرق الكشف عن النتائج

بعد اكتمال التفاعل، يتم التعرف على الأجزاء المكبرة من الحمض النووي للممرض باستخدام طرق مختلفة.

طريقة الرحلان الكهربائي للهلام معروفة جيدًا. في هذه الحالة، يتم تحديد قطعة الحمض النووي المُحصل عليها بواسطة عنصر تحكم إيجابي يحتوي على قطعة الحمض النووي المحددة المطلوبة، أو بواسطة حجم معروف مسبقًا (عدد أزواج النوكليوتيدات) للقطعة، والذي يُحدد باستخدام علامة جزيئية قياسية.

في وجود صبغة معينة - بروميد الإيثيديوم، والتي تدخل في تركيب الحمض النووي مزدوج السلسلة، يتم الكشف عن جزء الحمض النووي المُصنّع على شكل شريط يتوهج تحت تأثير الأشعة فوق البنفسجية.

يجب أن يتوافق حجم قطعة الحمض النووي، الذي يتم تحديده عن طريق التحليل الكهربائي على أساس المسافة المقطوعة من البداية، مع علامة الوزن الجزيئي المعروفة أو التحكم الإيجابي.

تعتمد الطرق الأخرى لتحديد نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل على تهجين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادية السلسلة مع أوليجونوكليوتيد مكمل - مسبار DNA مُسمى بالبيوتين، يليه الكشف باستخدام تفاعل إنزيمي عن طريق، على سبيل المثال، ربط مركب ستربتافيدين-فوسفاتاز قلوي بالبيوتين.

وبناءً على هذا النوع من الكشف، تم إنشاء أجهزة تحليل PCR حيث يتم الكشف عن نتائج PCR تلقائيًا نتيجة قراءة الكثافة البصرية في العينات بعد حدوث التفاعل الأنزيمي.

من عيوب هذه الطرق احتمالية التلوث داخل المختبر بأجزاء صغيرة نسبيًا من جزيئات الحمض النووي. عند دخول هذه الجزيئات إلى العينات المختبرة حديثًا، تصبح مصفوفة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

في هذا الصدد، ولمنع النتائج الإيجابية الخاطئة، تُطبّق قواعد صارمة لفصل وعزل الغرف: غرف استخراج الحمض النووي من العينات البيولوجية، وغرف كشف النتائج (الرحلان الكهربائي) عن المنطقة النظيفة. تُمثّل هذه الغرف منطقةً يُحتمل تلوثها. كما تُخصّص منطقة معزولة أخرى لغرفة نظيفة لإدخال عينات الحمض النووي قيد الدراسة في أنابيب اختبار مع خليط التفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وأخيرًا، يُفترض نقل الجهاز الرئيسي - مُضخّم الحمض النووي - إلى غرفة منفصلة، ربما في مكتب.

لمنع التلوث بنواتج التفاعلات السابقة - الأمبليكونات، تحتوي بعض أنظمة اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على ديوكسي نوكليوسيد يوريدين بدلاً من ديوكسي نوكليوسيد ثيميدين، الذي يُبنى في الموضع المقابل أثناء تخليق السلسلة في المختبر، أي أن قاعدة الثايمين النيتروجينية الموجودة في الحمض النووي الأصلي تُستبدل باليوراسيل. يُدمر إنزيم اليوراسيل DNA جليكوزيلاز المُضاف إلى خليط تفاعل المادة المُحللة الأجزاء الملوثة بالديوكسي يوريدين فقط، وليس الحمض النووي الأصلي المُحلل الذي يحتوي على ديوكسي ثيميدين. يُعطل التسخين اللاحق عند درجة حرارة 94 ^درجة مئوية هذا الإنزيم ولا يؤثر على التضخيم في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يوجد نظام اختبار يعتمد على التضخيم المتساوي الحرارة للرنا الريبوسومي، حيث تُجرى أولًا عملية النسخ العكسي وتخليق جزيئات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)، والتي تُمثل بدورها مصفوفة للتخليق اللاحق لجزيئات الحمض النووي الريبوزي. تُكتشف أمبليكونات الحمض النووي الريبوزي باستخدام مسبار الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) المصبوغ بالأكريدين أثناء التهجين في محلول أنبوب التفاعل. تتميز هذه الطريقة، بالإضافة إلى حساسيتها العالية، بإجراء التحليل في أنبوب واحد، مما يمنع التلوث. ووفقًا للباحثين، تصل حساسية هذه الطريقة في عينات الجهاز التنفسي إلى 90% مع خصوصية تتراوح بين 99% و100%.

تُطبَّق طرق كشف جديدة في تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (PCR). وتختلف هذه الطرق بشكل رئيسي في أن تفاعل البوليميراز المتسلسل وكشف نتائجه يُجرىان في آنٍ واحد في أنبوب اختبار مغلق واحد. وهذا لا يُبسِّط طريقة التحليل من الناحية التكنولوجية فحسب، بل يمنع أيضًا تلوث مباني المختبر والعينات بنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل السابق.

في تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (PCR)، تُكتشف النتائج عن طريق التألق الناتج عن تهجين مسبار الحمض النووي المُفلور مع جزء مُحدد من الحمض النووي مُضخّم أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. يُبنى هيكل مسابر الحمض النووي المُفلور بحيث لا يُطلق العلامة التألقية نتيجة تفاعل إنزيمي، أو لا تبتعد عن جزيء مُخمّد التألق إلا عند حدوث تهجين مُحدد مع جزيء الحمض النووي المطلوب المُضخّم أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. مع زيادة عدد الجزيئات المُهجّنة مع المسبار، فإن زيادة التألق إلى مستوى قابل للكشف تتناسب طرديًا مع عدد جزيئات الناتج المُضخّم. وبما أن عدد جزيئات جزء الحمض النووي يتضاعف خلال كل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل، فإن عدد الدورات التي يُكتشف فيها التألق ويزداد يتناسب عكسيًا مع عدد جزيئات الحمض النووي في العينة الأصلية. إذا تم إدخال عدة تركيزات مختلفة معروفة من جزيئات الجزء المقابل من الحمض النووي لبكتيريا السل في التفاعل كمعاير، فيمكن حساب عدد جينومات الحمض النووي في المادة التي تتم دراستها باستخدام برنامج كمبيوتر.

تُكرر كل عينة قياسية. المعيار الكمي هو الحد الأدنى لعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) اللازمة لظهور ونمو الفلورسنت القابل للكشف. يمثل المحور السيني عدد الدورات؛ بينما يمثل المحور الإحداثي قيمة الفلورسنت. تتناسب تركيزات الحمض النووي عكسيًا مع عدد الدورات اللازمة لظهور الفلورسنت. تُظهر النوافذ في العمود الأيمن (21-32) أرقام الدورات للتركيزات المقابلة. الفرق بين تركيزات شظايا الحمض النووي (10 ² - 10 ⁶ مل) البالغة 10 أضعاف هو 3.2-3.4 دورة. بالنسبة لمريضين، كانت تركيزات شظايا IS6110 حوالي 10 ³ /مل و10 ⁴ /مل. وبأخذ عدد التكرارات (6-20) من الأجزاء المحللة في جينوم المتفطرة السلية بعين الاعتبار، فإن عدد المتفطرة السلية في العينات السريرية يبلغ حوالي 100 و1000 خلية على التوالي.

تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص مرض السل

تُستخدم طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع للتشخيص السريع لمرض السل - الكشف عن المتفطرة السلية في العينات السريرية: البلغم، وغسيل القصبات الهوائية، والنضح الجنبي، والبول، والسائل النخاعي، وثقوب انحلال العظم، وشفطات الجهاز التناسلي الأنثوي، وخزعات مختلفة. في دراسة أجريت في هولندا على حوالي 500 عينة من البلغم وغسيل القصبات الهوائية من 340 مريضًا مصابًا بتشخيص مؤكد للسل الرئوي، تمت دراسة الحساسية المقارنة لطرق تفاعل البوليميراز المتسلسل، والزرع، والفحص المجهري باللطاخة. بلغت حساسية التحليل 92.6%، و88.9%، و52.4% على التوالي. بلغت خصوصية جميع الطرق حوالي 99%.

أُجريت مقارنة بين كفاءة الكشف عن المتفطرة السلية باستخدام مجهر اللطاخة، والزراعة على وسط لوينشتاين-جنسن، ونظام اختبار VASTES، وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل حساسيةً بلغت 74.4%، والمجهر 33.8%، والزراعة على وسط صلب 48.9%، وVASTES 55.8%. يبلغ متوسط مدة الكشف عن الزراعة على وسط لوينشتاين-جنسن 24 يومًا، بينما يستغرق الكشف على VASTES 13 يومًا، وPCR يوم واحد.

كما تمت مناقشة إمكانية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل كطريقة حساسة وسريعة لمراقبة فعالية علاج مرض السل.

يتم تحديد الكشف عن الحمض النووي لبكتيريا السل بطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع العلاج الكيميائي الفعال على مدى فترة زمنية أطول - في المتوسط 1.7 شهرًا مقارنة بالإفراز البكتيري الذي تم تحديده بواسطة المجهر الفلوري، و 2.5 شهرًا مقارنة بالفحص البكتريولوجي.

تشخيص أشكال السل خارج الرئة

إن أهمية تفاعل البوليميراز المتسلسل كطريقة حساسة كبيرة بشكل خاص بالنسبة للأشكال خارج الرئة، حيث أنه في هذه الأشكال بالتحديد تكون الطرق السريرية والإشعاعية والطرق البكتريولوجية التقليدية لتحديد المتفطرة السلية في المواد التشخيصية غير فعالة.

وعند فحص عينات البول كانت نتائج تحليل PCR إيجابية لدى 16 من 17 مريض مصاب بالسل النشط في الجهاز البولي وسلبية لدى 4 مرضى مصابين بالسل الكلوي غير النشط و39 مريض مصاب بأمراض غير سلية في الجهاز البولي.

تم إثبات فعالية تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في دراسة سحوبات نخاع العظم لدى مرضى مصابين بحمى مجهولة المصدر، يُشتبه في إصابتهم بالسل. ولتشخيص التهاب العقد اللمفاوية السلية لدى الأطفال، دُرست 102 عينة سحوبات وخزعات من 67 طفلاً يُشتبه في إصابتهم بالتهاب العقد اللمفاوية السلية. وحققت نتائج إيجابية: 71.6% باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، و46.3% باستخدام المجهر الفلوري، و41.8% باستخدام المزرعة. وفي دراسة أجريت على 50 خزعة من العقد اللمفاوية لدى مرضى مصابين بداء خدش القطة، كانت جميع النتائج سلبية. وبالتالي، أثبتت دقة تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بنسبة 100%. وفي الدراسة نفسها، ثبتت إمكانية الكشف عن بكتيريا المتفطرة الطيرية في خزعة العقد اللمفاوية الوخزية.

من المعروف أن تشخيص السل التناسلي الأنثوي في حالات العقم يُعد من أصعب المشكلات التشخيصية. وقد أظهرت دراسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لخزعات بطانة الرحم، وشفطات بطانة الرحم، وعينات سائل كيس دوغلاس نتائج إيجابية لدى 14 مريضة (56%) من أصل 25 مريضة فُحصن بالمنظار للاشتباه في إصابتهن بالسل. وأسفرت دراسات الفحص المجهري للطاخة والزرع عن نتيجة إيجابية واحدة واثنتين على التوالي. وكانت هذه الحالات أيضًا إيجابية لاختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل. وكانت معظم نتائج اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية في الحالات التي تحمل سمات مميزة للسل وفقًا للفحص النسيجي؛ بينما كان عدد أقل في الحالات التي يُشتبه في إصابتها بالسل وفقًا للتنظير. ولم تُسجل سوى نتيجة إيجابية واحدة لاختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في غياب بيانات التنظير للسل.

عند تشخيص أشكال السل خارج الرئة، غالبًا ما يتساءل الأطباء عن إمكانية تحديد العامل الممرض عند فحص عينات الدم باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تشير البيانات المنشورة إلى إمكانية الكشف عن الحمض النووي لبكتيريا السل من عينات الدم في الحالات المتقدمة من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. ولم يُكتشف الحمض النووي لبكتيريا السل إلا في حالات السل المعمم في مختلف الأعضاء لدى المرضى الذين خضعوا لزراعة كلية ويعانون من تثبيط المناعة.

[ 59 ]، [ 60 ]، [ 61 ]، [ 62 ]، [ 63 ]

تحديد أنواع البكتيريا الفطرية

يمكن أن تكون طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) فعالة للغاية في التعرف السريع على بكتيريا السل المعقدة وبعض أنواع البكتيريا غير السلية بعد الحصول على نموها الأولي. في هذه الحالة، يمكن أن يوفر استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ما بين 7 و10 أيام اللازمة لتحديد نتيجة إيجابية لاحقًا من خلال الزراعة. تُعد دراسة تفاعل البوليميراز المتسلسل بسيطة للغاية من الناحية الفنية، حيث لا تتطلب تحضيرًا معقدًا للعينات من المواد السريرية لتحقيق حساسية عالية. عند فحص 80 مزرعة إيجابية في نظام اختبار كهذا (MB BacT. من إنتاج شركة Organon)، كانت جميع نتائج تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية محددة بدقة وتم إجراؤها في غضون يوم واحد. لتحديد أنواع أخرى من البكتيريا الفطرية عند الحصول عليها في المزرعة، يتم تهجين الحمض النووي للممرض بمجسات DNA محددة مُوسومة بالأكريدين، ويتم الكشف عن السلالات من خلال ظهور الكيمياء الضوئية باستخدام مقياس الكيمياء الضوئية أو على شرائط النيتروسليلوز مع التقييم البصري بعد التهجين. تحدد هذه المجموعة عددًا محدودًا من الأنواع: معقد المتفطرة السلية، ومعقد المتفطرة الطيرية، ومعقد المتفطرة الطيرية، ومعقد المتفطرة الكنساسية، ومعقد المتفطرة الجوردونيا.

طوّر أ. تيلينتي وآخرون أيضًا طريقةً بسيطةً نسبيًا وغير مكلفة لتحديد أنواع المتفطرات ذات الأهمية السريرية، بالاعتماد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم معالجتها بإنزيمات تقييد (إنزيمات قادرة على قطع جزيء الحمض النووي في نقاط محددة). في هذه الحالة، تُضخّم قطعة الحمض النووي المُشفّرة لبروتين الصدمة الحرارية (65 كيلو دالتون)، وبعد ذلك تُعالَج قطعة الحمض النووي المُحصّلة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتي يبلغ حجمها 439 زوجًا من النيوكليوتيدات، بشكلٍ منفصلٍ بإنزيمين - Bste II وNae III. بعد ذلك، باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الأغاروزي، يُحلّل الناتجان المُحصّلان، ويُحدّد حجمهما (عدد أزواج النيوكليوتيدات) باستخدام مجموعة من قطع الحمض النووي القياسية (علامات الحمض النووي الجزيئية) التي يتراوح طولها بين 100 و1000 زوج من النيوكليوتيدات. في كل نوع من الأنواع المحددة (المتفطرة السلية، والمتفطرة الطيرية، والمتفطرة داخل الخلوية، والمتفطرة الكنساسية، والمتفطرة فورتيتوم)، توجد قطعتان أو ثلاث قطع من الحمض النووي بأحجام مختلفة لكل إنزيم تقييد. ويسمح دمج قطع الحمض النووي الناتجة ذات الأحجام المختلفة بتمييز هذه الأنواع عن بعضها البعض.

يتم تطوير تقنية لمصفوفات الحمض النووي البيولوجية والتي من شأنها أن تساعد في تحديد أكثر من 100 نوع من البكتيريا الفطرية في دراسة واحدة.

يمكن أيضًا إجراء التعرف على الأنواع باستخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمنطقة المتغيرة من 16S rRNA متبوعًا بتسلسل الأمبليكونات بالمقارنة مع البنية الأساسية المقابلة، مما يسمح بتحديد أكثر من 40 نوعًا من المتفطرات.

يمكن أيضًا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد الأنواع داخل مُركب بكتيريا السل، بما في ذلك التمييز بين المتفطرة البقرية (M. bovis) ولقاح BCG الخاص بالمتفطرة البقرية. يتم ذلك بتحليل وجود أو غياب جينات مُعينة في المناطق الجينومية RD1 وRD9 وRD10. لا يوجد RD1 في لقاح BCG للمتفطرة البقرية، ولكنه موجود في الأنواع شديدة الضراوة، بما في ذلك المتفطرة البقرية.

تحديد حساسية الأدوية لبكتيريا السل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل

تقتصر مهام الطرق الوراثية الجزيئية لتحديد حساسية أو مقاومة المتفطرة السلية للأدوية على تحديد الطفرات في تسلسلات نيوكليوتيدات معينة لجينات معروفة. تعتمد الطرق الرئيسية إما على القراءة المباشرة (التسلسل) لهذه التسلسلات بعد التضخيم، أو على تهجين شظايا الحمض النووي المُوسومة بالبيوتين والمُضخّمة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مسابر الحمض النووي. يتضمن كلا الخيارين تحديد الاستبدالات في تسلسلات النيوكليوتيدات التي تؤدي، عند استخدام مسابر الحمض النووي، إلى غياب التهجين أو عدم اكتماله على غشاء النيتروسليلوز باستخدام مُقترن إنزيمي (ستربتافيدين-فوسفاتاز قلوي) - طريقة LIPA-Rif-TB.

تُسمى طريقة قياس التألق في مجسات الحمض النووي المثبتة موضعيًا على المناطق الدقيقة المُكملة للطفرات المعروفة في مناطق الجينات المُضخّمة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمسؤولة عن حساسية الدواء أو مقاومته، بطريقة الرقائق الحيوية الدقيقة. الخوارزمية الأساسية لإجراء هذه الدراسة هي كما يلي: بعد عزل الحمض النووي من عينة سريرية أو مزرعة بكتيريا متفطرة، يجب إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الأجزاء المقابلة من جين groB المسؤول عن حساسية الدواء للريفامبيسين، أو جينات katG وinhA المُشفّرة لبروتينات البكتيريا المتفطرة المسؤولة عن حساسية الدواء للإيزونيازيد. تُقيّم نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الأغاروزي، والذي يؤكد استلام أجزاء الحمض النووي المقابلة بالطول المطلوب. بعد ذلك، تُجرى جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال علامة فلورية في الحمض النووي. تُؤكّد نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل مرة أخرى بالرحلان الكهربائي للهلام. بعد ذلك، يُجرى التهجين (الحضانة طوال الليل) مع غسل المادة المُحصل عليها على رقاقة حيوية، وهي عبارة عن عدد كبير من سلاسل الحمض النووي القصيرة (المجسات) المثبتة على صفيحة زجاجية صغيرة، مُكملةً لتسلسلات النيوكليوتيدات الخاصة بنوع بكتيريا السل الحساسة للأدوية عند نقاط الطفرات المحتملة، وكذلك للتسلسلات الطافرة المسؤولة عن مقاومة الأدوية. يُحدد موقع مجسات الحمض النووي على الصفيحة بدقة، ويُحدد مستوى التألق المُلاحظ أثناء التهجين لتحديد النتيجة باستخدام جهاز قراءة خاص. وفي هذا الصدد، تُحدد نتائج التحليل باستخدام برنامج حاسوبي خاص.

في السنوات الأخيرة، تم تطوير طرق بديلة لتحديد حساسية الدواء لبكتيريا السل على أساس تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، مما يسمح بإجراء هذه الدراسات في وضع أنبوب اختبار مغلق.

يوضح الشكل 13-13 نتائج تحليل المزارع السريرية لبكتيريا السل في تحديد مقاومة الريفامبيسين للدواء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: 218 عينة ضابطة (حساسة للريفامبيسين)؛ 93 عينة ضابطة إيجابية لطفرة Ser-Trp TCG-TGG؛ 4482 عينة ضابطة إيجابية لطفرة Ser-Leu TCG-TTG؛ 162-322 عينة تجريبية. نتيجة حساب المنحنيات الحركية للتضخيم لأربع قنوات: القناة 1: 393 عينة ضابطة إيجابية لطفرة Ser-Trp TCG-TGG؛ القناة 2: 4482 عينة ضابطة إيجابية لطفرة Ser-Leu TCG-TTG؛ 162، 163، 172، 295 عينة تجريبية؛ القناة 4: المنحنيات الحركية للتضخيم لجميع العينات المشاركة في التجربة. التضخيم الإيجابي لتفاعل التضخيم. الاستنتاجات: كشف التحليل عن الطفرات التالية التي تُحدد مقاومة الريفامبيسين: في العينات 162،163،172،295 - Ser-Leu TCG-TTG. واستُخدم المبدأ نفسه لتحديد مقاومة الإيزونيازيد بواسطة جينات katG وinhA، التي تُحدد الطفرات الأكثر شيوعًا.

[ 64 ]، [ 65 ]، [ 66 ]، [ 67 ]، [ 68 ]، [ 69 ]

تحديد سلالة المتفطرة السلية

الطريقة الأكثر دراسةً لتحديد سلالة المتفطرة السلية هي تقنية تُسمى تعدد أشكال طول شظايا التقييد (RFLP)، والتي تعتمد على تجزئة (تقييد) الحمض النووي للمتفطرة السلية بواسطة إنزيم Pvu II، ثم تهجين الشظايا الناتجة بتسلسلات محددة على الحمض النووي لعنصر التكرار IS6110. ويتحقق التباين داخل النوع بفضل اختلاف عدد تكرارات IS6110 وموقعها على الحمض النووي، بالإضافة إلى تنوع المسافات بين نقاط هجوم إنزيم التقييد (مواقع التقييد) وعنصر IS6110. هذه التقنية معقدة للغاية وتتطلب جهدًا كبيرًا. بعد معالجة الحمض النووي المعزول من مزرعة بكتيريا السل باستخدام إنزيم القطع، يُجرى الرحلان الكهربائي الهلامي، ثم تُنقل شظايا الحمض النووي بأطوال مختلفة إلى غشاء نيتروسليلوز، وتُهجّن بشظايا من عنصر IS6110، وتُكتشف النتائج باستخدام تفاعل إنزيمي. يُميّز نمط النطاق المحدد الناتج الحمض النووي لسلالة معينة من بكتيريا السل. يكشف التحليل الحاسوبي عن هوية السلالات أو علاقتها بها. على الرغم من أن طريقة RFLP هي الأكثر تمييزًا، أي أنها تكشف عن أكبر عدد من الاختلافات في السلالات المُحللة، إلا أنها غير فعالة مع عدد قليل (أقل من 5) من تكرارات IS6110، وهو ما لوحظ في بعض السلالات. يوضح الشكلان 13-14 نتائج تصنيف السلالات باستخدام RFLP.

قد يكون من البدائل طريقة التنميط الجيني (spoligotyping)، وهي تحليل تعدد أشكال تسلسلات الحمض النووي الفاصلة (DNA) الوسيطة بين التكرارات المباشرة لمنطقة DR. عند إجراء التنميط الجيني للسلالات، يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات تُحدد منطقة DR، وبعد ذلك تتشكل شظايا بأطوال مختلفة، تُهجن مع مناطق DNA وسيطة مختلفة. ويبدو تحليل تسلسلات الفواصل في منطقة DR، وفقًا للباحثين، أبسط وأكثر فعالية، وملائمًا للفحص الأولي للسلالات والتحليل الوبائي الأولي، بالإضافة إلى دراسة المواد السريرية مباشرةً.

من الواضح أن طريقة VNTR (اختصار لكلمات إنجليزية)، أو طريقة تحديد العدد المتغير للتكرارات الترادفية الدقيقة في الحمض النووي لبكتيريا السل، هي الطريقة الأكثر فعالية وسهولة من الناحية التكنولوجية. تعتمد هذه الطريقة فقط على استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولا تتطلب أي معالجة إضافية. ونظرًا لاختلاف عدد التكرارات الترادفية في السلالات المختلفة وفي المواقع الجينية المختلفة، يتم تحديد شظايا مختلفة الأحجام وتحليلها باستخدام مخطط كهربية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. ووفقًا للباحثين، يُحقق استخدام VNTR درجة تمييز أعلى للسلالات مقارنةً بطريقة RFLP.

وقد تم توجيه قدر كبير من الاهتمام في السنوات الأخيرة إلى انتشار سلالات المتفطرة السلية من عائلة بكين الغربية (والتي تسمى أحيانًا سلالة بكين)، والتي تعد مقاومة إلى حد كبير للأدوية.

المتطلبات الأساسية لجودة البحوث البيولوجية الجزيئية

[ 70 ]، [ 71 ]، [ 72 ]، [ 73 ]

الوثائق التنظيمية الرئيسية لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل

قرارات وزارة الصحة في الاتحاد الروسي: رقم 45 بتاريخ 7 فبراير 2000؛ رقم 109 بتاريخ 21 مارس 2003؛ رقم 64 بتاريخ 21 فبراير 2000. المبادئ التوجيهية: 1.3.1888-04 "تنظيم العمل أثناء أبحاث تفاعل البوليميراز المتسلسل للمواد المصابة بعوامل بيولوجية ممرضة من مجموعات الإمراض الثالثة والرابعة"؛ 1.3.1794-03 "تنظيم العمل أثناء أبحاث تفاعل البوليميراز المتسلسل للمواد المصابة بكائنات دقيقة من مجموعات الإمراض الأولى والثانية". 2003؛ 3.5.5.1034-01 "تطهير مواد الاختبار المصابة ببكتيريا من مجموعات الإمراض الأولى والرابعة عند العمل بطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل"، 2001. الملحق 11 للتعليمات الخاصة بالطرق الموحدة للأبحاث الميكروبيولوجية في الكشف عن مرض السل وتشخيصه وعلاجه.

[ 74 ]، [ 75 ]، [ 76 ]

طاقم عمل

يمكن إجراء الدراسات البيولوجية الجزيئية من قبل أطباء التشخيص المختبري السريري، وعلماء البكتيريا، وعلماء الفيروسات، وعلماء الأحياء المختبرية التشخيصية السريرية، وكذلك المتخصصين ذوي التعليم الطبي الثانوي الذين خضعوا للتخصص والتدريب المتقدم بالطريقة المعمول بها.

ترتيب مباني المختبر

المرافق المعملية المطلوبة هي:

• منطقة معالجة العينات - مختبر مُهيأ للعمل مع العوامل المعدية لمجموعات الإمراض III-IV، وفقًا للمبادئ التوجيهية المنهجية 13.1888-04.
• تعتبر منطقة تحضير مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن غرفة مختبر توفر الحماية من التلوث الداخلي للمختبر - منطقة "نظيفة".
• في حال استخدام الرحلان الكهربائي أو التهجين لتحليل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يجب عزل غرفة المختبر التي تُستخرج منها شظايا الحمض النووي المُضخّمة من أنبوب التضخيم، وبالتالي يُسمح بدخولها إلى البيئة، عزلًا تامًا عن الغرف المحددة في الفقرات السابقة. يجب استبعاد أي حركة للأفراد أو المعدات أو المواد أو الأغراض من منطقة الرحلان الكهربائي إلى منطقة معالجة العينات ومنطقة "التنظيف"، وكذلك انتقال الهواء عبر نظام التهوية أو نتيجة تيارات الهواء. هذه المنطقة غير مطلوبة للكشف الفلوري عن نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
• غرفة توثيق ومعالجة النتائج مُجهزة بأجهزة حاسوب ومعدات مكتبية ضرورية. قد تحتوي هذه الغرفة على معدات تضمن الكشف عن نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) دون فتح الأنبوب. - كاشفات تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلورية، ومُدوّرات حرارية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

المتطلبات الصحية والوبائية للمعالجة الأولية للبلغم مماثلة للمتطلبات الميكروبيولوجية القياسية للعمل مع المتفطرة السلية.

[ 77 ]، [ 78 ]، [ 79 ]، [ 80 ]

مجموعة كاملة من المعدات المخبرية لتشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل

تتضمن مجموعة المختبر المعدات اللازمة للغرف التالية.

• غرفة تحضير العينات، تحتوي على المعدات التالية: غطاء تدفق رقائقي من فئة الحماية الثانية "SP-1.2": ترموستات الحالة الصلبة مع غطاء ساخن لأنابيب اختبار إيبندورف؛ جهاز طرد مركزي صغير بسرعة 13000 دورة في الدقيقة؛ جهاز طرد مركزي ("Vortex")؛ ثلاجة بمدى درجة حرارة من -20 ^درجة مئوية إلى +10 ^درجة مئوية؛ ماصات ذات حجم متغير من سلسلة "Proline"؛ مضخة مع قارورة مصيدة OM-1؛ رف ماصة؛ رف محطة عمل 200 × 0.5 مل؛ رف محطة عمل 50 × 1.5 مل؛ رفوف لتخزين أنابيب الاختبار 80 × 1.5 مل؛
• غرفة تحضير خليط التفاعل: صندوق PCR للغرفة الواقية ("Laminar-C. 110 سم)؛ جهاز الطرد المركزي "Vortex"؛ ماصات ذات حجم متغير من سلسلة "Proline"؛ رف ماصة؛ رف محطة عمل 200 × 0.2 مل؛ رفوف لتخزين أنابيب الاختبار 80 × 1.5 مل؛ ثلاجة بمدى درجة حرارة من -20 ^درجة مئوية إلى +10 ^درجة مئوية؛
• غرفة الرحلان الكهربائي: غرفة الرحلان الكهربائي الأفقية؛ مصدر الطاقة؛ جهاز الإضاءة؛
• مُضخِّم الحمض النووي أو مُحلِّل الأحماض النووية (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي) مُزوَّد بجهاز كمبيوتر وبرنامج؛ يُمكن وضعه في أي غرفة مُتاحة. في حال استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، لا حاجة لغرفة الرحلان الكهربائي.

[ 81 ]، [ 82 ]، [ 83 ]، [ 84 ]

مراقبة الجودة الخارجية

ولضمان الحصول على نتائج موثوقة وموضوعية، يتعين على المختبرات المشاركة في نظام التقييم الخارجي لجودة الأبحاث المختبرية.

يتلقى المشاركون في نظام مراقبة الجودة: 12 أمبولة تحتوي على معلقات مجففة بالتجميد من الخلايا البكتيرية، اثنتان منها تحتويان على الإشريكية القولونية، و3 أمبولات تحتوي على بكتيريا السل (سلالة ضارة) بتركيز 10 ² / مل؛ و3 أمبولات تحتوي على خلايا من سلالة مماثلة بتركيز 10 ⁴ / مل؛ و2 أمبولة تحتوي كل منها على بكتيريا غير سلية وهي M. avium-intracellulare وM. kansasii بتركيز 10 ⁵ / مل.

يتم اختبار الاختبارات المرسلة لتقييم الجودة الخارجي مسبقًا في مختبرين مستقلين يتمتعان بخبرة واسعة في هذا المجال.

[ 85 ]، [ 86 ]