قارورة واحدة، هدفان: تشخيص السل المحمول القائم على تقنية كريسبر بحساسية 100%

نُشرت في مجلة "ساينس أدفانسز" ورقة بحثية حول اختبار سل محمول يُمكن إجراؤه مباشرةً من البلغم، دون الحاجة إلى معدات معقدة. يُدمج تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة وقراءة كريسبر في أنبوب اختبار واحد؛ ويُختبر إدخالان متحفظان من المتفطرة السلية (IS6110 وIS1081) في آنٍ واحد، بالإضافة إلى جين بشري كعينة ضابطة داخلية. في اختبار "أعمى" صغير على عينات سريرية، أعطى الاختبار حساسية 100% (6/6) وخصوصية 100% (7/7) مقارنةً بالزرع؛ ويتراوح حد الكشف بين 69 و81 وحدة تشكيل مستعمرة/مل في البلغم المُحاكى. يمكن رؤية النتيجة على شريط اختبار ورقي، وتُجفف الكواشف بالتجميد (تخزين بدون "سلسلة تبريد").

خلفية

وفقًا لمنظمة الصحة العالمية، سيودي السل بحياة حوالي 1.25 مليون شخص في عام 2023؛ وقد عاد السل ليصبح السبب الرئيسي للوفاة المعدية، حيث يُقدر عدد حالات الإصابة به بنحو 10.8 مليون حالة. وهذا يجعل التشخيص السريع والمتاح أمرًا بالغ الأهمية، لا سيما في البيئات محدودة الموارد.

• الاختبارات الحالية تُمثل حلاً وسطًا بين الدقة والسرعة والسعر. ثقافة "المعيار الذهبي" دقيقة للغاية لكنها بطيئة؛ المجهر سريع لكنه غير حساس؛ منصات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مثل Xpert MTB/RIF Ultra أكثر حساسية بكثير (LOD ≈ 15.6 CFU/ml)، لكنها تتطلب معدات وخراطيش باهظة الثمن، مما يحد من التغطية.
• لماذا نستخدم تقنية التضخيم المتساوي الحرارة وتقنية كريسبر ؟ تعمل تقنية التضخيم المتساوي الحرارة لـ RPA عند درجة حرارة تتراوح بين 37 و42 درجة مئوية، ولا تتطلب دورات حرارية، مما يجعلها عملية في الميدان. تُضيف قراءة كريسبر (Cas12/13) خصوصية للأنواع، وتسمح بالتدفق الجانبي البصري ("الشريط") دون تعقيدات بصرية. إجمالاً، هذا هو الطريق لاختبارات PVR المحمولة والرخيصة.
• لماذا يُستخدم هدفان MBT في آنٍ واحد (IS6110 + IS1081). يُعدّ IS6110 ملحقًا متعدد النسخ من مُركّب السل ، ولكن بعض السلالات تحتوي على نسخ قليلة، وقد تُخطئ اختبارات IS6110 وحده. تُقلّل إضافة ملحق IS1081 ثانٍ من خطر النتائج السلبية الكاذبة.
• لماذا يُجرى التحكم البشري الداخلي ؟ قد تحتوي عينات التنفس على مثبطات وعينات "سيئة". يؤكد التحكم البشري الداخلي (مثل RNase P/الحمض النووي الجينومي) أن المادة كافية وأن التفاعل غير مُثبط، وإلا فلا يمكن اعتبار النتيجة سلبية.
• يُعدّ نظام الوعاء الواحد مهمًا بحد ذاته. فهو يُقلّل الخطوات، ويُقلّل من خطر التلوث، ويُسهّل العمل خارج المختبر. وقد أثبتت هذه الأساليب فعاليتها في علاج السل؛ ويوسّع العمل الجديد نطاق الفكرة ليشمل نظامًا ثنائي الهدف مع ضوابط داخلية، بالإضافة إلى إثبات تجفيد الكواشف وقارئ الشرائط.
• ما قيمة هذه المقالة ؟ أظهر المؤلفون إمكانية الكشف مباشرةً من البلغم بعد تحضير عينة مبسط للغاية، وحد الكشف عند حوالي 70-80 وحدة تشكيل مستعمرة/مل في البلغم المُحاكى، وحساسية/خصوصية 100% على مجموعة صغيرة من العينات السريرية المُعمّاة - وهو عرض تقني جيد لمزيد من التحقق متعدد المراكز.

كيف يعمل هذا

• قام العلماء بدمج تقنية التضخيم الحراري السريع للمادة الوراثية (RPA) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع إنزيمات القطع Cas13a/Cas12a. بعد اختيار الحمض النووي الريبوزي الدليل، قاموا بتكوين النظام لاستهداف هدفين من بروتينات MBT في وقت واحد، وبالتوازي مع الحمض النووي البشري (مع التأكد من وجود مادة في العينة وعدم توقف التفاعل).
• يتم وضع كل المواد الكيميائية في أنبوب اختبار واحد؛ بعد الحضانة، تتم قراءة النتيجة إما باستخدام مقياس الفلوريسنت أو على شريط تدفق جانبي - مثل الاختبار السريع في الأساس.
• تم تبسيط عملية معالجة البلغم لتشمل التسخين واستخدام جهاز طرد مركزي قصير، دون الحاجة إلى مستخلصات الأحماض النووية. وفي الحالات المحدودة، يناقش المؤلفون حتى البدائل اليدوية لجهاز الطرد المركزي.

ماذا أظهرت الاختبارات

• حد الكشف: ٦٩.٠ وحدة تشكيل مستعمرة/مل (سلالة H37Rv) و٨٠.٥ وحدة تشكيل مستعمرة/مل (لقاح BCG) في بلغم "سبايك". لم يُكتشف أي تفاعل متبادل مع بكتيريا/فطريات أخرى.
• البيئة السريرية (عينات مُعمّاة): في ١٣ عينة من الممارسة العملية، بلغت نسبة الحساسية ١٠٠٪ (٦/٦) والخصوصية ١٠٠٪ (٧/٧) مقارنةً بالزرع. وللمقارنة، أظهر جين إكسبرت ألترا في نفس المجموعة نسبة ١٠٠٪ و٨٦٪ على التوالي.
• الفروق التقنية: من بين خياري القراءة، كان أداء Cas13a أفضل (بالنسبة لنموذج "الوعاء الواحد"، فهو أكثر حساسية من Cas12a). بالإضافة إلى ذلك، يُقلل الاختبار المتوازي لهدفين من داء السل من خطر الحصول على نتائج خاطئة.

لماذا هذا ضروري؟

تُمثل اختبارات اليوم حلاً وسطًا بين الدقة والسرعة والتوافر: فالزراعة دقيقة جدًا لكنها بطيئة؛ والمسحات سريعة لكنها غير دقيقة؛ وأنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مثل جين إكسبرت دقيقة وسريعة لكنها تتطلب أدوات وخراطيش باهظة الثمن. يهدف نهج كريسبر الجديد إلى سد هذه الفجوة: التشخيص الميداني الذي يعمل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع قراءات شرائط ورقية، وإمكانية تخزين الكواشف دون تبريد.

القيود وما هو التالي

هذا عرضٌ تجريبيٌّ مبكرٌ لمجموعةٍ سريريةٍ صغيرة، إذ يلزم إجراء اختباراتٍ واسعةٍ ومتعددة المراكز (بما في ذلك العدوى المشتركة بفيروس نقص المناعة البشرية لدى الأطفال، مع أشكالٍ قليلة العصيات وسلالاتٍ مختلفةٍ من MBT). يُشير المؤلفون بشكلٍ منفصلٍ إلى أنه في النسخة "الميدانية" نفسها، سيتعين استبدال جهاز الطرد المركزي المكتبي بمحلولٍ يدويٍّ بالكامل. لكن البنية نفسها - "هدفان + تحكمٌ داخلي" في أنبوب اختبارٍ واحد - أثبتت فعاليتها بالفعل، وتُتيح مسارًا واضحًا للتحسين للاستخدام الجماعي.

المصدر: ألكسندرا ج. بيل وآخرون. اختبار مُبسَّط قائم على تقنية كريسبر للكشف عن السل مباشرةً من البلغم ، ساينس أدفانسز، متاح على الإنترنت في 6 أغسطس/آب 2025 (المجلد 11، العدد 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206